李 輝，趙 亮，李建貴，張 磊 ，董樹(shù)清，孫振榮，邱洪燈

(1.中國(guó)科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆紅果果農(nóng)林科技有限公司，新疆 烏魯木齊 830052)

環(huán)磷酸腺苷(cyclic Adenosine-3,5-Mono Phosphate，cAMP)，是核苷酸的衍生物[1]，分子式C10H12N5O6P.1980年Cyong等[2]首次發(fā)現(xiàn)紅棗含有動(dòng)物體內(nèi)存在的環(huán)磷酸腺苷.作為“第二信使”的環(huán)磷酸腺苷是有機(jī)體中廣泛存在的一種重要的生理活性物質(zhì),參與多種生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié).現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明外源性環(huán)磷酸腺苷具有改善心肌缺氧、擴(kuò)張冠脈、增強(qiáng)心肌收縮力、增加心排血量等作用，可用于心絞痛、急性心肌梗死的輔助治療[3-4].世界各國(guó)研究人員對(duì)cAMP進(jìn)行了大量的研究, 結(jié)果表明cAMP在很多領(lǐng)域具有重要作用[5-6].

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，紅棗中含有多種豐富的化學(xué)物質(zhì), 如含多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、有機(jī)酸和多種微量元素[7-9].同時(shí)，紅棗中cAMP的含量也是已知植物中最高的，是向日葵、煙草、大米、松樹(shù)、生菜等其他植物的1 000倍甚至數(shù)萬(wàn)倍左右[10-12].cAMP也是紅棗中最重要的生物活性物質(zhì)之一, 但是不同品種的紅棗，其含量差異較大.隨著紅棗綜合利用和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展以及醫(yī)療和保健行業(yè)對(duì)cAMP 的需求，從紅棗中提取cAMP受到了越來(lái)越多的關(guān)注[13].高效液相色譜(HPLC)因高效的分離能力被認(rèn)為是最有效的分離技術(shù)之一[14].因此，采用HPLC法測(cè)定紅棗中cAMP的含量的比較準(zhǔn)確有效，具有開(kāi)發(fā)價(jià)值[15-17].目前，雖然已有對(duì)紅棗中環(huán)磷酸腺苷的成分結(jié)構(gòu)及含量的報(bào)道[18-19]，但對(duì)我國(guó)紅棗主產(chǎn)地北方地區(qū)，不同區(qū)域不同品種紅棗中cAMP含量的測(cè)定和比較工作未見(jiàn)報(bào)道.

因此，本文以我國(guó)北方不同產(chǎn)地不同品種16種紅棗為研究對(duì)象，應(yīng)用HPLC法測(cè)定其cAMP含量并對(duì)不同地區(qū)不同品種作比較.該方法提取工藝簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可以為我國(guó)北方地區(qū)紅棗深加工品種篩選提供參考依據(jù)，有助于紅棗高值化利用和推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀(包含Waters 515HPLC Pump , Waters 996二極管陣列檢測(cè)器, N-3000 雙通道色譜工作站)；超聲波振蕩器(KQ5200型)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；調(diào)溫型電熱套(MH-5000型)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52C型)；電熱鼓風(fēng)干燥箱；臺(tái)式高速離心機(jī)(TG16-WS型)；電子秤(FA1004型).

試劑：紅棗樣品為市售，產(chǎn)地分別來(lái)自甘肅、新疆、寧夏、山東，陜西、遼寧等地.甲醇(色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司)，冰醋酸(利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)公司)，環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%)，工業(yè)乙醇，去離子水(Molresearch 1010a 10L/H型).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 方法與結(jié)果

紅棗中cAMP含量的測(cè)定方法：將各種紅棗樣品烘干、粉碎，在最優(yōu)條件下進(jìn)行提取，以提取液中cAMP的質(zhì)量和紅棗干粉質(zhì)量之比作cAMP含量測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行[3].

(1)

1.2.2 波長(zhǎng)選擇

對(duì)cAMP標(biāo)準(zhǔn)品水溶液進(jìn)行紫外掃描, 結(jié)果如圖1所示.由圖1可見(jiàn)，cAMP 在波長(zhǎng)210、254 nm 處吸收最大, 因?yàn)樵?10 nm 以下溶解時(shí)，氧有吸收, 干擾較大, 故檢測(cè)波長(zhǎng)選用254 nm.

1.2.3 色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

色譜柱為Hibar ODS-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)柱, 流動(dòng)相為甲醇: 2%醋酸(體積比為5∶95), 流速 0.5 mL/min，檢測(cè)器為Waters 996，檢測(cè)溫度為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm, cAMP標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示.標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：精密稱(chēng)取cAMP標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并定容至刻度線，搖勻得0.1 mg /mL儲(chǔ)備液.

稱(chēng)取50 mg環(huán)磷酸腺苷標(biāo)品，溶于50 ml水配成1.0 mg/mL環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，之后分別配置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行液相色譜檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3所示)，得到回歸方程為：Y=8.260 8×107C-261 530.2,R2為0.998 2.表明cAMP在 0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度的線性關(guān)系良好.

圖3 cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.4 樣品處理及檢測(cè)

分別將不同產(chǎn)地的16種紅棗切片，40 ℃干燥48 h，粉碎機(jī)磨成粉狀.準(zhǔn)確稱(chēng)取各種紅棗粉100 g，800 mL 80%乙醇溶液加熱煮沸提取2 h，過(guò)濾得到提取液，然后再加入800 mL 80%乙醇溶液加熱煮沸提取2 h，過(guò)濾得到提取液，所得上清液合并濃縮，以 8 000 r/min離心15 min，取上清液用蒸餾水定容至100 mL刻度處.過(guò) 0.22 μm微孔濾膜，用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定.

1.2.5 環(huán)磷酸腺苷提取單因素試驗(yàn)

選擇料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以環(huán)磷酸腺苷含量作為環(huán)磷酸腺苷提取效果的評(píng)價(jià)指標(biāo).

(1)料液比對(duì)cAMP提取率影響：以新疆駿棗為試驗(yàn)材料，在加熱提取2 h，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的條件下，選取1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 這5個(gè)料液比水平研究對(duì) cAMP 提取率的影響，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，隨著料液比的增加，提取液中cAMP的含量增加，1∶8之后提取率增加幅度不太明顯.因此可選用于料液比為1∶8對(duì)紅棗中環(huán)磷酸腺苷進(jìn)行提取.

圖4 料液比對(duì) cAMP 提取率的影響

(2)提取時(shí)間對(duì)cAMP提取率影響:在料液比1∶8、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80% 的條件下，選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 5個(gè)加熱提取時(shí)間研究對(duì)cAMP提取率的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率增加，在2 h時(shí)達(dá)到最大值，之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)提取率降低，可能是加熱提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞中其他物質(zhì)溶出，影響cAMP的提取.因此可選用加熱提取時(shí)間為2 h對(duì)紅棗中環(huán)磷酸腺苷進(jìn)行提取.

圖5 提取時(shí)間對(duì) cAMP 提取率的影響

(3)提取溫度對(duì)cAMP提取率影響：在料液比1∶8、加熱提取時(shí)間2 h、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的條件下，選取20、40、60、80、100 ℃ 5個(gè)提取溫度，研究對(duì) cAMP 提取率的影響，結(jié)果如圖6所示.由圖6可以看出，隨著加熱溫度的升高，cAMP的含量也逐漸增大.溫度超過(guò)80 ℃，達(dá)到100 ℃ 煮沸提取時(shí)，紅棗細(xì)胞壁破碎煮爛以后隨著其他可溶性成分增加，cAMP提取率降低且煮爛后續(xù)分離難度隨之增加，因此選擇以80 ℃為最佳的環(huán)磷酸腺苷提取溫度.

圖6 溫度對(duì) cAMP 提取率的影響

(4)提取次數(shù)對(duì)cAMP提取率影響：在料液比1∶8、加熱提取時(shí)間2 h、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、加熱溫度為80 ℃的條件下，進(jìn)行4次提取，研究對(duì) cAMP 提取率的影響，結(jié)果如圖7所示.由圖7可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，cAMP的含量先逐漸增大后減小.因?yàn)殡S著提取次數(shù)的增加，cAMP的含量隨之減少，紅棗中其他可溶性部分繼續(xù)溶出，影響對(duì)cAMP提取,考慮到能源損耗以及cAMP含量的影響選擇提取次數(shù)為2次.

圖7 提取次數(shù)對(duì) cAMP 提取率的影響

(5)不同乙醇濃度對(duì)cAMP提取率影響：在料液比1∶8、加熱提取時(shí)間2 h、2次提取、加熱溫度為80 ℃條件下，選取乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、40%、60% 和80%，研究5個(gè)不同濃度梯度對(duì) cAMP 提取率的影響，結(jié)果如圖8所示.由圖8可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，cAMP的含量先逐漸增大后減小.因?yàn)樵诩円掖继崛r(shí)環(huán)磷酸腺苷溶解性降低且其他脂溶性溶解質(zhì)溶出，cAMP的含量隨之減少，影響對(duì)cAMP提取，因此選擇最佳乙醇提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%.

圖8 不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì) cAMP 提取率的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 精密度

取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的cAMP標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，自動(dòng)進(jìn)樣，采用HPLC測(cè)定其cAMP 含量.平行測(cè)定6次，計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.63%，結(jié)果如表1所列，表明該法精密度良好.

表1 精密度試驗(yàn)

2.2 重現(xiàn)性

同一批次樣品溶液6份, 分別按照上述色譜條件測(cè)定, 以峰面積與濃度的比值計(jì)算, 得到cAMP的RSD為1.6%，結(jié)果如表2所列.

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

2.3 回收率

取已知含量的新疆駿棗樣品溶液 6 份各10 mL, 精密加入等量cAMP標(biāo)準(zhǔn)品, 分別吸取1.0 mL定容到10 mL量瓶中, 經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后, 進(jìn)樣檢測(cè).測(cè)得平均回收率為102.1%，結(jié)果如表3所列.

2.4 我國(guó)北方16種紅棗中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量的測(cè)定比較

采用高效液相色譜測(cè)定16種紅棗中的cAMP的含量，其中新疆駿棗的液相色譜圖如圖9所示，另外我國(guó)北方16種棗中cAMP的含量如表4所列.

表3 回收率試驗(yàn)

圖9 新疆駿棗中cAMP 含量測(cè)定

表4 北方16種紅棗中cAMP含量

3 結(jié)論

采用HPLC 法分析紅棗中含量極微的 cAMP，準(zhǔn)確度高，精確度好.通過(guò)研究新疆駿棗及我國(guó)北方地區(qū)共16種紅棗的cAMP含量，建立了HPLC法分析紅棗中cAMP 含量方案.在供試樣品中，測(cè)得新疆駿棗cAMP 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(372 μg/g)，并對(duì)我國(guó)北方16種紅棗的cAMP 含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)新疆紅棗具有種類(lèi)豐富且cAMP含量高的特點(diǎn)，非常有利于cAMP的開(kāi)發(fā)利用.該方法操作簡(jiǎn)便靈敏度高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好, 可作為大棗的質(zhì)量控制方法，且對(duì)紅棗進(jìn)行深加工、帶動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)起到積極的作用.