丁 博,謝建軍,王志元,陶移文,黃洪波,陳文銳,姚孝寶

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 廣東 廣州 511436; 2. 廣州海關(guān)技術(shù)中心, 廣東 廣州 510623;3. 青海省冬蟲夏草協(xié)會(huì), 青海 西寧 810007; 4. 青海貢草生物科技有限公司, 青海 西寧 810007)

自1913年英國物理學(xué)家湯姆遜首次發(fā)現(xiàn)氖穩(wěn)定同位素以來[1],科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)自然界中61種元素含有穩(wěn)定同位素,穩(wěn)定同位素具有特殊的地理、化學(xué)和生物等信息,引起科研工作人員的好奇與興趣,隨著現(xiàn)代物理與化學(xué)技術(shù)的發(fā)展,碳、氮、氫、氧、硫等輕元素的穩(wěn)定同位素天然豐度的測(cè)量手段逐漸形成一種新型同位素分析技術(shù)[2],該技術(shù)廣泛應(yīng)用于地球科學(xué)、古生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)、司法鑒定、食品質(zhì)量控制(真實(shí)性鑒定與產(chǎn)地溯源)等領(lǐng)域[3]。

1 同位素比質(zhì)譜簡(jiǎn)述

1.1 穩(wěn)定同位素分析

穩(wěn)定同位素分析是一種根據(jù)構(gòu)成物質(zhì)的碳、氫、氧、氮、硫等輕元素在物理、化學(xué)、生物等外界因素作用下出現(xiàn)同位素分餾現(xiàn)象,進(jìn)行元素的穩(wěn)定同位素比測(cè)定,追蹤物質(zhì)來源的分析技術(shù)。自然界中輕元素的同位素天然豐度都非常小,穩(wěn)定同位素分析時(shí),所需測(cè)量?jī)x器的精密度數(shù)量級(jí)達(dá)到10-6～10-4[4,5],然而,常規(guī)四極桿、離子阱、飛行時(shí)間等質(zhì)量分析器的精密度在0.05%～2%之間,達(dá)不到同位素測(cè)定要求,直接測(cè)定樣品中特定化合物中輕元素的同位素比值非常困難[6]。于是人們采用轉(zhuǎn)換氣體模式間接測(cè)定碳、氫、氧、氮、硫等輕元素同位素天然豐度比,比如,通過氫氣測(cè)氫同位素比,二氧化碳測(cè)定碳穩(wěn)定同位素比,一氧化碳測(cè)氧穩(wěn)定同位素比、氮?dú)鉁y(cè)定氮穩(wěn)定同位素比和二氧化硫測(cè)定硫穩(wěn)定同位素比[7]。為了準(zhǔn)確地描述穩(wěn)定同位素的天然豐度比,20世紀(jì)40年代來自芝加哥哈羅德尤里實(shí)驗(yàn)室的Mckinney學(xué)者首先引入δ值的概念,用來表達(dá)穩(wěn)定同位素豐度比[8]。

δ值定義為穩(wěn)定同位素天然豐度相對(duì)比值[8],樣品同位素豐度比(R(hEs/lEs))與國際基準(zhǔn)參考物質(zhì)的同位素豐度比(R(hEref/lEref))差值,除以國際基礎(chǔ)參考物質(zhì)的同位素豐度比,從而得到相對(duì)國際基準(zhǔn)參考物質(zhì)的同位素豐度比值,單位為‰。

(1)

其中,R為同位素豐度比值,E為元素,h為重同位素質(zhì)量數(shù),l為輕同位素質(zhì)量數(shù),s為樣品,ref為國際基準(zhǔn)參考物質(zhì)。比如穩(wěn)定碳同位素比分析,國際基準(zhǔn)參考物質(zhì)是南卡羅來納州的白堊紀(jì)海洋化石(vienna pee dee belemnite, VPDB),其13C/12C值是0.011 180 2[9],樣品中碳同位素比如下:

(2)

1.2 同位素比質(zhì)譜儀

同位素比質(zhì)譜儀是由樣品進(jìn)樣系統(tǒng)、電子轟擊離子源系統(tǒng)、磁場(chǎng)質(zhì)量分析器系統(tǒng)、多通道法拉第杯檢測(cè)器系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)等5個(gè)系統(tǒng)構(gòu)成,其中多通道法拉第杯為高通量收集專屬離子檢測(cè)器[3]。比如,碳同位素檢測(cè)分析時(shí),每個(gè)法拉第杯檢測(cè)器分別檢測(cè)m/z44、45和46 3種特定離子(見圖1)。

圖 1 同位素比質(zhì)譜儀構(gòu)成示意圖Fig. 1 Schematic of isotope ratio mass spectrometry

根據(jù)樣品進(jìn)樣有無外設(shè)裝置預(yù)處理,可將穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)分為雙進(jìn)氣道進(jìn)樣型同位素比質(zhì)譜(dual inlet-isotope ratio mass spectrometry, DI-IRMS)技術(shù)和連續(xù)進(jìn)樣型聯(lián)用同位素比質(zhì)譜(continuous flow-isotope ratio mass spectrometry, CF-IRMS)技術(shù),其中CF-IRMS包括元素分析-同位素比質(zhì)譜(elemental analyzers-isotope ratio mass spectrometry, EA-IRMS)、在線氣體制備-同位素比質(zhì)譜(gas bench-isotope ratio mass spectrometry, GB-IRMS)、氣相色譜-同位素比質(zhì)譜(gas chromatography-isotope ratio mass spectrometry, GC-IRMS)和液相色譜-同位素比質(zhì)譜(liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry LC-IRMS)[2,3]。

1.2.1DI-IRMS

DI-IRMS主要應(yīng)用于地質(zhì)年代考究學(xué)科領(lǐng)域。為了研究古地球的環(huán)境狀況,科研工作者借助無脊椎動(dòng)物有孔蟲類沉積化石中碳酸鈣的穩(wěn)定碳和氧同位素比,間接推測(cè)地球的演化進(jìn)程[3,10]。1950年加拿大學(xué)者M(jìn)cCrea[11]發(fā)明了碳酸鹽釋放CO2檢測(cè)氧和碳同位素比的McCrea方法,不久英美學(xué)者Shackleton和Opdyke兩人[12]利用McCrea方法,直接將碳酸鹽釋放的CO2引入同位素比質(zhì)譜儀中檢測(cè)分析有孔蟲類化石穩(wěn)定氧和碳同位素比,用于推測(cè)地球的演化歷史。

1.2.2GB-IRMS

GB-IRMS是一種將樣品在線制備成CO2與H2等氣體后,直接通入穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀中進(jìn)行穩(wěn)定碳、氧和氫同位素比的測(cè)定方法。主要應(yīng)用于水中穩(wěn)定氧和氫同位素比的測(cè)定[13]、環(huán)境中無機(jī)碳和有機(jī)碳穩(wěn)定同位素比測(cè)定[14,15],以及CaCO3巖石中碳穩(wěn)定同位素比測(cè)定[16]等領(lǐng)域。GB-IRMS前處理外設(shè)裝置最早是由美國賽默飛公司生產(chǎn)的第一代Gas-bench設(shè)備,現(xiàn)已發(fā)展到了第二代Gas-bench Ⅱ設(shè)備[17]。

1.2.3EA-IRMS

EA-IRMS是一種檢測(cè)固態(tài)和液態(tài)全樣品的同位素分析技術(shù),是目前應(yīng)用最廣泛的一種同位素分析技術(shù)[18]。δ2H和δ18O的測(cè)定原理是高溫裂解反應(yīng):液體樣品直接通過液體自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,固體樣品用銀杯包裹后通過固體自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,均是進(jìn)入1 380 ℃高溫裂解爐中進(jìn)行裂解反應(yīng),在玻璃化碳粒還原劑作用下生產(chǎn)H2和CO等混合氣體,經(jīng)過恒溫氣相色譜柱分離獲得純的H2和CO后,通過ConFlo IV裝置進(jìn)入IRMS主機(jī)中,測(cè)定樣品的δ2H和δ18O。樣品δ13C和δ15N的檢測(cè)原理是高溫氧化反應(yīng):錫杯包裹的樣品通過固體自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入由Cr2O3氧化劑、Cu還原劑、Ag2Co3O4脫鹵素劑、玻璃棉等材料構(gòu)成的石英燃燒管中,980 ℃高溫快速燃燒作用下,將目標(biāo)物轉(zhuǎn)化為CO2和N2混合氣體,經(jīng)過恒溫氣相色譜柱分離獲得純的N2和CO2氣體依次進(jìn)入IRMS主機(jī)中,測(cè)定樣品中的δ13C和δ15N[19,20]。當(dāng)前EA-IRMS通常和GC-IRMS或LC-IRMS聯(lián)用,測(cè)定樣品中特征化合物的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值[21,22]。

1.2.4GC-IRMS

1978年兩位美國學(xué)者M(jìn)attews和Hayes[23]設(shè)計(jì)出了世界上第一臺(tái)離線的GC-IRMS儀器,應(yīng)用于樣品的特征化合物同位素分析領(lǐng)域中;1984年科研人員又研究開發(fā)了在線GC-IRMS儀器,在線分析樣品中特征化合物的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O[24],從而實(shí)現(xiàn)了GC-IRMS儀器的商業(yè)化。自此,GC-IRMS特征化合物同位素分析技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于地球化學(xué)、古生物學(xué)、環(huán)境化學(xué)和食品真實(shí)鑒定等領(lǐng)域[25-27]。

GC-IRMS關(guān)鍵部件是GC IsoLink接口設(shè)備,決定著GC分離后的目標(biāo)物是否能進(jìn)入IRMS主機(jī)中,進(jìn)行目標(biāo)化合物的穩(wěn)定同位素比的測(cè)定。GC IsoLink主要由高溫燃燒管、可移動(dòng)高溫裂解管、氣液分離膜裝置和參考?xì)怏w與稀釋氣體裝置等部件構(gòu)成。在樣品的δ13C、δ15N測(cè)定時(shí),像Flash EA的高溫氧化檢測(cè)原理一樣,用一根燃燒管實(shí)現(xiàn)樣品中C和N元素的氣體轉(zhuǎn)化。測(cè)定樣品的δ2H和δ18O時(shí),使用GC IsoLink內(nèi)置不同的O裂解管和H裂解管,分別產(chǎn)生CO和H2氣體,其中O裂解管中不像Flash EA裂解管里面填裝玻璃碳粒,而是事先將樣品碳化而截留下來碳作為還原劑,高溫裂解將樣品中的O元素成分轉(zhuǎn)化為CO氣體;H裂解管中填充鉑催化劑,樣品中H元素成分,在1 450 ℃高溫裂解催化作用下轉(zhuǎn)化H2氣體[28]。

1.2.5LC-IRMS

與GC-IRMS相比,LC-IRMS是一種開發(fā)應(yīng)用比較晚的特征化合物同位素分析技術(shù)。主要原因是氣體穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜檢測(cè)分析的對(duì)象為相對(duì)分子質(zhì)量小的氣體,比如CO2、N2和H2等,而液相色譜經(jīng)過色譜分離后獲得純的液體化合物,如何將液體化合物轉(zhuǎn)化為待測(cè)氣體是LC-IRMS面臨的一大技術(shù)瓶頸。直到2004年Thermo公司的德國技術(shù)團(tuán)隊(duì)[29]研究開發(fā)出了濕法氧化LC Isolink接口設(shè)備,實(shí)現(xiàn)了LC-IRMS儀器設(shè)備的商品化。從此,LC-IRMS走入科研工作人員的視線中,相對(duì)于GC-IRMS,LC-IRMS可用于非揮發(fā)性化合物的測(cè)定,具有樣品的非衍生化預(yù)處理等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。目前LC-IRMS逐漸地開始應(yīng)用于食品質(zhì)量安全、考古學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和地球化學(xué)等領(lǐng)域。

2 LC-IRMS概述

2.1 LC-IRMS發(fā)展歷史

LC-IRMS是同位素比質(zhì)譜家族中最晚研究開發(fā)出來的一種商業(yè)化儀器,但是卻有著十幾年的技術(shù)研發(fā)歷史。1993年美國Caimi和Brenna[30]兩位學(xué)者最早開發(fā)了LC與IRMS聯(lián)用儀器設(shè)備,他們?cè)O(shè)計(jì)出了用可移動(dòng)金屬絲裝置去除溶劑和燃燒目標(biāo)分析物的LCM-2接口設(shè)備。其工作原理是液相色譜的流出組分首先通過Cu和Pt涂層的移動(dòng)金屬絲,在150 ℃干燥室作用下,蒸發(fā)去除流動(dòng)相溶劑,接著金屬絲移動(dòng)至高溫燃燒室,高溫燃燒將目標(biāo)物轉(zhuǎn)化成CO2氣體,一定程度上解決了樣品的溶劑去除及目標(biāo)物的氣體轉(zhuǎn)化等技術(shù)瓶頸,實(shí)現(xiàn)了LC與IRMS直接聯(lián)用;但是該接口設(shè)備在實(shí)際樣品的測(cè)定時(shí),有著回收率與準(zhǔn)確度低,設(shè)備使用壽命短等致命缺陷。1996年Brand等學(xué)者[31]改進(jìn)了早期的移動(dòng)金屬絲接口設(shè)備,提高了接口設(shè)備的使用壽命與檢測(cè)靈敏度,目標(biāo)化合物的絕對(duì)碳含量達(dá)20 pg以上,即可檢測(cè)到樣品中特征化合物的δ13C。同年,Teffera技術(shù)團(tuán)隊(duì)[32]設(shè)計(jì)出了化學(xué)反應(yīng)接口設(shè)備,該設(shè)備的工作原理是液相色譜流動(dòng)相依次經(jīng)過驅(qū)除溶劑的噴霧器,霧化氣體在反應(yīng)室內(nèi)縱向擴(kuò)散,接著通入氧氣,將目標(biāo)物全部氧化成CO2氣體,采用動(dòng)量分離器分離氣體與液體,待測(cè)CO2氣體干燥進(jìn)入IRMS主機(jī),進(jìn)行目標(biāo)化合物的δ13C測(cè)定。

2004年Thermo公司的Michael Krummen技術(shù)團(tuán)隊(duì)[29]研究開發(fā)了第一款商品化的LC-IRMS接口設(shè)備——LC IsoLink裝置,克服了以往接口設(shè)備準(zhǔn)確度低、氧化不充分和同位素分餾效應(yīng)等技術(shù)缺陷問題。該接口設(shè)備由氧化反應(yīng)管、冷卻器、氣液分離單元、氣體干燥器和氣體開發(fā)分流器5個(gè)單元構(gòu)成,采用濕式化學(xué)氧化法的工作原理;樣品中目標(biāo)化合物首先經(jīng)過液相色譜分離后,與磷酸和過硫酸鈉溶液混合進(jìn)入氧化管,在99.9 ℃溫度條件下將化合物全部氧化為CO2氣體,接著冷卻、氣液分離與干燥后,最后待測(cè)氣體進(jìn)入IRMS主機(jī)進(jìn)行δ13C的測(cè)定。2010年英國Isoprime公司的Morrison技術(shù)團(tuán)隊(duì)[33]設(shè)計(jì)了第二款商業(yè)化的LC-IRMS接口設(shè)備Liquiface,該接口設(shè)備也是采用濕式氧化方法的工作原理,在液態(tài)條件下將目標(biāo)化合物全部氧化轉(zhuǎn)成CO2氣體,與LC IsoLink非常相似,不同的部分是該接口設(shè)備多了一個(gè)去離子水泵,構(gòu)成三元泵系統(tǒng)。

2.2 LC-IRMS技術(shù)分類

LC-IRMS接口設(shè)備的技術(shù)原理是目標(biāo)分析物通過濕式化學(xué)氧化法轉(zhuǎn)化為CO2氣體,對(duì)樣品特征化合物的δ13C進(jìn)行檢測(cè)分析;因此,該技術(shù)嚴(yán)格限制外源碳的引入,導(dǎo)致液相色譜流動(dòng)相不能用有機(jī)溶劑等體系,只能用純水,以及純水加入磷酸緩沖液、稀磷酸、稀硫酸或稀氫氧化鈉溶液等作為流動(dòng)相。根據(jù)液相色譜分離原理,目前將LC-IRMS分為離子交換色譜、反相液相色譜和混合型色譜等3種聯(lián)用技術(shù)。

2.2.1離子交換色譜聯(lián)用同位素比質(zhì)譜技術(shù)

自Thermo公司推出了第一款商業(yè)化的LC IsoLink接口設(shè)備以來,離子交換色譜率先與同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)用,用于糖類、碳水化合物等特征化合物同位素分析中。該聯(lián)用技術(shù)原理是糖類等碳水化合物可在純水或低濃度的酸及堿等不含碳源的流動(dòng)相體系下,通過離子交換色譜柱實(shí)現(xiàn)單糖、二糖、多糖等混合物的分離,達(dá)到特征化合物δ13C測(cè)定的目的。

2.2.2反相液相色譜聯(lián)用同位素比質(zhì)譜技術(shù)

由于LC-IRMS的液相色譜流動(dòng)相不能使用有機(jī)溶劑的緣故,限制了反相液相色譜與同位素比質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展。直到2008年,瑞士學(xué)者Godin等[34]提出了類似氣相色譜的程序升溫的高溫液相色譜分離技術(shù),實(shí)現(xiàn)了反相液相色譜與同位素比質(zhì)譜的聯(lián)用。該技術(shù)的特點(diǎn)是在高溫條件下,降低水的黏度而提高洗脫能力,使其達(dá)到有機(jī)溶劑的洗脫能力[35]。目前,反相液相色譜聯(lián)用同位素比質(zhì)譜技術(shù)越來越多的應(yīng)用于非揮發(fā)的特征化合物同位素分析領(lǐng)域之中。

2.2.3混合型色譜聯(lián)用同位素比質(zhì)譜技術(shù)

美國SIELC公司推出反相C18與離子交換基團(tuán)復(fù)合型Primesep系列色譜柱產(chǎn)品,此類色譜柱具有離子交換作用和反相C18吸附解吸的作用,在低溫及純水流動(dòng)相條件下,實(shí)現(xiàn)小分子化合物的分離,促使了一種新型的特征化合物同位素分析技術(shù)的產(chǎn)生。該LC-IRMS技術(shù)比較適合復(fù)雜基質(zhì)樣品的測(cè)定,極大地拓寬了LC-IRMS特征化合物同位素分析的應(yīng)用范圍。

3 國外LC-IRMS的研究進(jìn)展

自從商業(yè)化的LC IsoLink接口設(shè)備問世以來,LC-IRMS逐漸地開始應(yīng)用于食品安全、環(huán)境科學(xué)、生態(tài)學(xué)、考古學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域,尤其是食品安全和環(huán)境科學(xué)兩個(gè)學(xué)科領(lǐng)域(見表1)。

3.1 食品安全

食品安全問題一直是國內(nèi)外消費(fèi)者關(guān)注的頭等大事,從早期關(guān)注農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、添加劑、重金屬等污染物的問題,到近20年來,開始關(guān)注食品真實(shí)性及溯源的問題。歐盟是世界上最早開展食品真實(shí)性、欺詐問題研究的國家地區(qū),2013年舉行的歐洲食品質(zhì)量安全會(huì)議中,明確提出了重點(diǎn)關(guān)注橄欖油、魚類、有機(jī)食品、牛奶、谷類、蜂蜜、咖啡與茶、調(diào)味料、紅酒和果汁飲料等十大產(chǎn)品的欺詐問題,并制定了相關(guān)的檢測(cè)方法[43],其中同位素技術(shù)由于其獨(dú)特的追蹤溯源特點(diǎn),在食品真實(shí)性及欺詐檢測(cè)領(lǐng)域中備受科研工作者的關(guān)注與重視。比如,西班牙學(xué)者González-Martin等[51]利用穩(wěn)定同位素技術(shù)測(cè)定伊比利亞豬肉的δ13C值,以此判定市場(chǎng)流通的豬肉食品是否為伊比利亞豬肉。

表 1 近3年來LC-IRMS的應(yīng)用情況

LC-IRMS作為一種特征化合物同位素分析技術(shù),最早應(yīng)用于食品的真實(shí)性鑒定領(lǐng)域之中。2006年西班牙學(xué)者Cabaero等[21]利用LC-IRMS檢測(cè)蜂蜜中葡萄糖、果糖及蔗糖的δ13C值,結(jié)合EA-IRMS測(cè)定蜂蜜的總樣品和蛋白質(zhì)δ13C值,根據(jù)δ13C值判定蜂蜜的摻雜問題,在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)分析方法(AOAC 998.12),克服了蜂蜜的全樣品同位素分析技術(shù)存在的誤判問題。德國的兩位學(xué)者Elflein和Raezke[52]利用EA/LC-IRMS測(cè)定451個(gè)純蜂蜜和摻雜蜂蜜樣品的全樣品(honey)、蛋白質(zhì)(protein)、葡萄糖(glucose, glu)和果糖(fructose, fru)的δ13C值,其中全樣品和蛋白質(zhì)的δ13C值采用EA-IRMS測(cè)定,葡萄糖和果糖的δ13C值采用LC-IRMS測(cè)定,歸納整理出了δ13C值鑒定蜂蜜摻雜問題的3個(gè)指標(biāo)條件:-2.1‰<δ13CEA-max-δ13CLC-max<2.1‰, -1‰<δ13Cfru-δ13Cglu<1‰,δ13Cprotein-δ13Choney≥-1‰,同時(shí)滿足這3個(gè)指標(biāo)參數(shù)的蜂蜜為純蜂蜜,否則為摻雜蜂蜜。2008年Cabaero等[53]又利用LC-IRMS和GC-IRMS技術(shù)檢測(cè)紅酒中乙醇的δ13C值,并與傳統(tǒng)的EA-IRMS方法相比,結(jié)果表明LC-IRMS和GC-IRMS特征化合物同位素分析技術(shù)顯著地提高了樣品的檢測(cè)效率,特別是LC-IRMS技術(shù),30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了紅酒中乙醇δ13C值的測(cè)定(見圖2)。

圖 2 LC-IRMS檢測(cè)紅酒中乙醇的δ13C值[53]Fig. 2 δ13C value of ethanol in a wine sample by LC-IRMS[53]

英國和德國兩國學(xué)者[54]利用LC-IRMS檢測(cè)虹鱒魚中氨基酸的δ13C值,以此探討虹鱒魚的蛋白質(zhì)合成途徑及其營養(yǎng)價(jià)值。Zhang等[55]利用LC-IRMS檢測(cè)咖啡因的δ13C值,在純水流動(dòng)相與高柱溫色譜分離條件下,利用Waters Xbridge C18反相液相色譜柱分離咖啡、茶葉及飲料中的咖啡因,IRMS測(cè)定咖啡因的δ13C值,獲得天然咖啡因的δ13C值分布范圍(-25‰～-32‰)以及人工合成咖啡因δ13C值分布范圍(-33‰～-38‰),以此判斷市場(chǎng)上銷售的飲料是否為天然來源產(chǎn)品。法國學(xué)者Guyon等[56]利用LC-IRMS檢測(cè)檸檬汁中有機(jī)酸、葡萄糖和果糖的δ13C值,在80 ℃柱溫和純水流動(dòng)相條件下,采用Carbohydrate 700 CH糖柱分離檸檬汁中有機(jī)酸、葡萄糖和果糖等特征化合物成分,獲得樣品中特征化合物的δ13C值,以此判斷檸檬汁是否摻雜了C4植物來源的有機(jī)酸或糖。意大利學(xué)者Bononi等[57]采用LC-IRMS檢測(cè)巧克力及巧克力食品中香蘭素的δ13C值,判別香蘭素是否為天然來源。

3.2 環(huán)境與生態(tài)學(xué)領(lǐng)域

除了食品真實(shí)性鑒定領(lǐng)域之外,LC-IRMS也應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)與生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中。德國學(xué)者Heuer等[58]首次將LC-IRMS技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中,檢測(cè)海洋沉積物孔隙水中揮發(fā)性有機(jī)酸的δ13C值,根據(jù)碳同位素指標(biāo)信息評(píng)價(jià)海洋沉積物中厭氧代謝物的產(chǎn)生、遷移與轉(zhuǎn)化規(guī)律。美國學(xué)者Brandes[59]利用LC-IRMS快速檢測(cè)海洋中溶解無機(jī)碳的δ13C值,用于預(yù)測(cè)一定區(qū)域生態(tài)環(huán)境中海洋系統(tǒng)吸收人類活動(dòng)產(chǎn)生的碳排放量的情況。法國學(xué)者Albéric[60]提出用LC-IRMS檢測(cè)河流與土壤水中溶解有機(jī)碳的δ13C值,并與有機(jī)碳分析儀的測(cè)定方法相比,結(jié)果表明LC-IRMS是一種準(zhǔn)確度高的溶解有機(jī)碳的測(cè)定方法。美國和瑞士研究人員[61]利用LC-IRMS檢測(cè)特征化合物苯多羧酸的δ13C值,獲得土壤中高溫有機(jī)質(zhì)的化學(xué)屬性、儲(chǔ)量及轉(zhuǎn)化率等信息,用于環(huán)境污染物的治理、有機(jī)肥料使用等相關(guān)領(lǐng)域的評(píng)估研究之中。德國學(xué)者Indorf等[62]利用LC-IRMS檢測(cè)植物與真菌體內(nèi)特征化合物氨基葡萄糖的δ13C值,用于研究腐生真菌的形成與遷移過程。Scheibe等[63]利用LC-IRMS檢測(cè)土壤中溶解有機(jī)質(zhì)的碳同位素比及碳含量,以此研究土壤中有機(jī)質(zhì)對(duì)碳運(yùn)輸、儲(chǔ)存及釋放等碳循環(huán)的影響。Kujawinski等[64]利用高溫LC-IRMS檢測(cè)土壤、水體等環(huán)境中草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基磷酸的δ13C值,鑒定環(huán)境中草甘膦除草劑污染物的來源及代謝路徑。德國學(xué)者Gilevska等[65]利用HPLC-IRMS測(cè)定極性氯化物的δ13C值,構(gòu)建了一種準(zhǔn)確度高的氯化污染物檢測(cè)分析方法,以評(píng)估公共衛(wèi)生環(huán)境中氯化物的污染情況(見圖3)。

圖 3 HPLC-IRMS檢測(cè)氯化乙酸污染物的δ13C值的流程圖[65]Fig. 3 Scheme of the HPLC isotope ratio mass spectrometry system for halogenated compounds[65]

LC-IRMS還應(yīng)用于環(huán)境污染物的遷移轉(zhuǎn)化機(jī)理研究之中。Birkigt等[66]運(yùn)用LC-IRMS檢測(cè)磺胺甲惡唑等污染物的δ13C值,探討磺胺甲惡唑的細(xì)桿菌生物降解和光催化降解等兩種途徑,研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定碳同位素比可準(zhǔn)確地追蹤磺胺甲惡唑的降解過程。Wei等[67]利用LC-IRMS測(cè)定苯酚和對(duì)甲酚的δ13C值,通過苯酚和對(duì)甲酚的需氧微生物和厭氧微生物降解的穩(wěn)定碳同位素分析,最終闡明了污染物的需氧及厭氧微生物降解機(jī)理。美國學(xué)者Powers等[38]運(yùn)用LC-IRMS檢測(cè)天然水體中溶解有機(jī)碳及其光降解產(chǎn)物溶解無機(jī)碳的δ13C值,構(gòu)建一種天然水體中光降解產(chǎn)物溶解無機(jī)碳的定量分析方法。

3.3 生命科學(xué)領(lǐng)域

LC-IRMS特征化合物同位素分析技術(shù)不但廣泛應(yīng)用于食品、生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域,還應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域之中。瑞士學(xué)者Godin等[68]首次將LC-IRMS應(yīng)用于血管緊張素Ⅲ和亮氨酸δ13C值的測(cè)定,構(gòu)建低濃度生物大分子和小分子化合物的δ13C分析方法。Schierbeek等[69]利用LC-IRMS檢測(cè)新生兒體內(nèi)甘氨酸及甘氨酸二肽的δ13C值,用于研究新生兒體內(nèi)谷胱甘肽的動(dòng)力學(xué)合成過程。澳大利亞學(xué)者Tea等[70]運(yùn)用EA-IRMS、GC-IRMS和LC-IRMS研究乳腺癌細(xì)胞代謝物的碳和氮穩(wěn)定同位素比時(shí),選擇RS park KC-811離子排阻色譜柱,純水流動(dòng)相洗脫分離細(xì)胞代謝物,從而檢測(cè)細(xì)胞代謝物的δ13C值。Moerdijk-P等[71]利用LC-IRMS檢測(cè)DNA和RNA中核苷酸的δ13C值,用于追蹤分析DNA和RNA的生物化學(xué)合成路徑。英國學(xué)者M(jìn)orrison等[72]利用LC-IRMS檢測(cè)血液中葡萄糖和半乳糖的δ13C值,探討機(jī)體運(yùn)動(dòng)期間血液中半乳糖與葡萄糖的代謝轉(zhuǎn)換機(jī)理。

3.4 考古學(xué)

在考古學(xué)研究領(lǐng)域中,LC-IRMS常用于檢測(cè)分析骨頭或頭發(fā)等組織中氨基酸的δ13C值,重現(xiàn)古人類的飲食習(xí)慣。英國學(xué)者M(jìn)cCullagh等[73]首次利用LC-IRMS檢測(cè)分析人與動(dòng)物骨頭膠原蛋白中18種氨基酸的δ13C值,重構(gòu)了古人類的肉食生活習(xí)慣。德國學(xué)者Choy等[74]利用LC-IRMS檢測(cè)9個(gè)人類和22個(gè)動(dòng)物樣品骨頭膠原蛋白中氨基酸的δ13C值,發(fā)現(xiàn)Tongsamdong和Nukdo兩地的人與動(dòng)物體內(nèi)必需氨基酸和非必需氨基酸具有相似的分布規(guī)律,海洋動(dòng)物的δ13C值相對(duì)陸地動(dòng)物具有較高的同位素富集效應(yīng),人類氨基酸的δ13C值置于海洋動(dòng)物與陸地動(dòng)物δ13C值之間,據(jù)此判定不同地方古代人類的食物類型是海洋或陸地來源。澳大利亞和智利兩國科研人員[37]利用LC-IRMS檢測(cè)木乃伊頭發(fā)中角質(zhì)蛋白中氨基酸的δ13C值,重現(xiàn)了古人類的飲食結(jié)構(gòu),用于推測(cè)古第四紀(jì)的人類棲息遷移歷程。

3.5 其他應(yīng)用領(lǐng)域

除了上述4個(gè)領(lǐng)域之外,LC-IRMS還應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度分析鑒定、司法鑒定以及地球科學(xué)等領(lǐng)域。西班牙學(xué)者Diaz等[75]利用LC-IRMS分析人工合成多肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度,并與氨基酸分析方法以及ICP-MS方法相比,研究顯示LC-IRMS分析結(jié)果符合美國國際標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所標(biāo)準(zhǔn)品NIST8327的要求。比利時(shí)學(xué)者Janssens等[76]綜述了穩(wěn)定同位素技術(shù)在天然的內(nèi)生雌激素和人工合成雌激素之間差異鑒定中的研究進(jìn)展,并指出LC-IRMS可應(yīng)用于興奮劑檢測(cè)等司法鑒定領(lǐng)域之中。澳大利亞和法國兩國學(xué)者[77]還將LC-IRMS拓展應(yīng)用到地球科學(xué)領(lǐng)域,用于檢測(cè)次生沉積巖中有機(jī)質(zhì)等特征化合物的碳同位素比,以此探索古地球環(huán)境中氣候與地表植物的變化。

4 近年來國內(nèi)IRMS的研究進(jìn)展

1996年熊永強(qiáng)和耿安松[78]在國內(nèi)雜志上發(fā)表了一篇有關(guān)同位素比質(zhì)譜技術(shù)的論文,綜述GC-IRMS在地球化學(xué)中的應(yīng)用情況。自此,國內(nèi)科研工作者開始了同位素比質(zhì)譜技術(shù)的相關(guān)技術(shù)研究工作。2000年汪聰慧等[79]率先利用同位素比質(zhì)譜測(cè)定硝銨炸藥TNT的來源,將同位素比質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用到司法犯罪證據(jù)調(diào)查領(lǐng)域。目前國內(nèi)關(guān)于同位素比質(zhì)譜技術(shù)的研究主要集中在GasBenchⅡ-IRMS、GC-IRMS和EA-IRMS等技術(shù)領(lǐng)域,LC-IRMS方向的研究甚少,以下概述分析國內(nèi)IRMS的研究進(jìn)展。

4.1 同位素比質(zhì)譜技術(shù)的研究狀況

GasBench-IRMS側(cè)重于穩(wěn)定氫和氧的同位素比測(cè)定,廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域。王華等[80]運(yùn)用GasBenchⅡ-IRMS進(jìn)行環(huán)境水體中氫和氧穩(wěn)定同位素比的研究,采用CO2-H2O平衡法和鉑催化H2-H2O平衡法測(cè)定水體中δ18O和δD,實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)分析數(shù)據(jù)表明GasBenchⅡ-IRMS測(cè)定δ18O和δD的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。徐勝等[81]利用GasBenchⅡ-IRMS測(cè)定新鮮橙汁中水的穩(wěn)定氧同位素比,判斷市場(chǎng)上銷售的橙汁真?zhèn)巍｀嵜舴嫉萚82]通過改造GasBenchⅡ-IRMS儀器系統(tǒng),使其可以測(cè)定氮穩(wěn)定同位素比,應(yīng)用于海水中硝酸鹽的15N和18O的檢測(cè)。

EA-IRMS是國內(nèi)應(yīng)用最廣泛的一種同位素比質(zhì)譜技術(shù),近年來EA-IRMS技術(shù)主要應(yīng)用于食品與農(nóng)產(chǎn)品的溯源及真假鑒定領(lǐng)域中。梁莉莉等[83]采用EA-IRMS追蹤分析嬰幼兒配方奶粉的奶源產(chǎn)地,研究結(jié)果顯示δ13C和δ15N與奶粉的產(chǎn)地來源具有顯著的相關(guān)性。譚夢(mèng)茹等[84]利用EA-IRMS檢測(cè)葡萄汁中δ13C值,根據(jù)葡萄汁中糖和有機(jī)酸的δ13C的差值范圍(-1.63‰～0.72‰)鑒定葡萄汁的真假。王修寧等[85]運(yùn)用EA-IRMS測(cè)定食醋總碳的δ13C值,根據(jù)δ13C值判斷芳香醋、糯米釀造食醋和蘋果醋等醋的類型。費(fèi)曉慶等[86]根據(jù)EA-IRMS檢測(cè)蜂王漿中碳穩(wěn)定同位素比值,通過蜂王漿蛋白質(zhì)和蜂王漿總樣品的δ13C值鑒定蜂王漿的真假,當(dāng)Δδ13C ≥-0.95 ‰,蜂王漿總樣品的δ13C≤-21.5‰時(shí),判定此類產(chǎn)品為純正的蜂王漿,否則為摻雜品。盧安根等[87]采用EA-IRMS分析?；撬岬奶己偷€(wěn)定同位素比,依此判斷南珠貝肉的真實(shí)性,結(jié)果顯示δ13C和δ15N與牛磺酸的含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。金貴善等[88]采用EA-IRMS測(cè)定有機(jī)氮和無機(jī)氮的δ15N,研究結(jié)果表明δ15N測(cè)量的準(zhǔn)確性與所選擇的標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)性質(zhì)相關(guān)。碳、氫、氧等輕元素的穩(wěn)定同位素比測(cè)定一般選擇同位素比質(zhì)譜技術(shù),近年來還出現(xiàn)了核磁共振技術(shù)和同位素比質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用一起用于樣品同位素比值的測(cè)定,其中核磁共振技術(shù)主要根據(jù)特異性天然同位素分餾-核磁共振技術(shù)原理進(jìn)行樣品穩(wěn)定同位素比的測(cè)定[89]。

GC-IRMS是一種特征化合物同位素分析的檢測(cè)技術(shù),廣泛應(yīng)用于食品、生態(tài)科學(xué)、地質(zhì)科學(xué)、興奮劑檢測(cè)等領(lǐng)域之中。趙孔祥等[90]運(yùn)用GC-IRMS檢測(cè)葡萄酒中乙醇、甘油、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸和2,3-丁二醇等特征化合物的δ13C值,依此判斷不同地區(qū)來源的葡萄酒。郭蓮仙等[91]先采用脂肪酸甲酯化前處理植物油和動(dòng)物油等食用油中的甘油三酯成分,再利用GC-IRMS檢測(cè)甲酯化后甘油三酯的δ13C,以此判斷植物油和動(dòng)物油的差別。吳浩等[92]利用GC-IRMS測(cè)定葡萄酒中乙醇、丙三醇、乙酸、乳酸乙酯和2-甲基丁醇的δ13C值,構(gòu)建δ13C判別分析模型鑒別葡萄酒的產(chǎn)地來源。陳航等[93]根據(jù)GC-IRMS分析白酒中乙醇的δ13C值,發(fā)現(xiàn)醬香型白酒中乙醇的δ13C值范圍是-19.53‰～-19.11‰,根據(jù)δ13C值分布區(qū)間判斷白酒真?zhèn)魏蛽郊賳栴}。趙超敏等[94]運(yùn)用GC-IRMS檢測(cè)分析黃油中5種類固醇激素的δ13C值,單因素方差分析結(jié)果顯示內(nèi)源性孕酮和外源性孕酮具有顯著的差異性。在生態(tài)科學(xué)研究領(lǐng)域方面,趙晶晶等[95]根據(jù)GC-IRMS測(cè)定氨基酸的氮穩(wěn)定同位素比,通過氨基酸的衍生化處理,進(jìn)行氨基酸特征化合物的δ15N值分析,判定水生生物的營養(yǎng)級(jí)別。在地質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域方面,雷知生等[96]利用GC-IRMS檢測(cè)天然氣水合物氣體中碳和氫穩(wěn)定同位素比,構(gòu)建天然氣水合物樣品中烴類氣體碳?xì)渫凰貦z測(cè)分析方法,鑒別天然氣水合物的構(gòu)成成分。王希彬等[97]利用GC-IRMS測(cè)定天然氣中微量烴類化合物成分,構(gòu)建固相微萃取聯(lián)用GC-IRMS的烴類化合物同位素分析方法。在興奮劑藥物的檢測(cè)方面,王靜竹等[98]建立了GC-IRMS檢測(cè)運(yùn)動(dòng)員尿液中19-去甲雄酮和19-去甲本膽烷醇酮δ13C的分析方法,鑒定運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)的興奮劑類型是內(nèi)源性物質(zhì)或是外源性物質(zhì),從而判斷運(yùn)動(dòng)員是否服用了違禁的興奮劑藥物。

4.2 LC-IRMS技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

LC-IRMS是最新的一種特征化合物同位素分析技術(shù),目前國內(nèi)的研究報(bào)告甚少,大約發(fā)表17篇相關(guān)的科研論文,主要集中在食品真實(shí)性檢測(cè)與溯源領(lǐng)域。2011年國內(nèi)首次報(bào)道了LC-IRMS結(jié)合EA-IRMS測(cè)定蜂蜜的δ13C,采用Ca離子交換色譜柱分離果糖和葡萄糖,研究結(jié)果顯示,當(dāng)蜂蜜樣品滿足蜂蜜蛋白質(zhì)與蜂蜜的Δδ13C值≥-0.95‰,果糖和葡萄糖的Δδ13C值在-0.64‰～-0.53‰之間,各組分間的最大Δδ13C值<2.09‰等3個(gè)條件,判定樣品為純的蜂蜜產(chǎn)品,該研究結(jié)論與國際報(bào)道的蜂蜜δ13C值判定標(biāo)準(zhǔn)相一致[99]。羅東輝等[100]也采用LC-IRMS和EA-IRMS鑒定蜂蜜產(chǎn)品的真假,運(yùn)用氨基柱色譜柱分離蜂蜜中單糖、二糖和三糖等成分,根據(jù)樣品Δδ13C判定蜂蜜是否摻雜了C4植物糖漿。同年李學(xué)民等[101]根據(jù)單一的LC-IRMS方法測(cè)定蜂蜜中糖組分的δ13C值,利用Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)分離果糖、葡萄糖、二糖和三糖,根據(jù)蜂蜜中糖的δ13C差值范圍,判定蜂蜜是否摻雜了外源糖成分。此外,還有其他學(xué)者也采用LC-IRMS和EA-IRMS聯(lián)合技術(shù)檢測(cè)蜂蜜中蛋白質(zhì)、果糖、葡萄糖、二糖和三糖,根據(jù)不同組分間Δδ13C值的范圍,判別蜂蜜是否摻雜了外源糖成分[102-105]。

LC-IRMS技術(shù)除了應(yīng)用于蜂蜜的真假鑒定方面之外,還應(yīng)用于果汁的真假鑒定領(lǐng)域之中。李鑫等[106]采用LC-IRMS檢測(cè)橙汁中果糖、葡萄糖、二糖和多糖的δ13C值,通過人工壓榨和摻雜兩種方法制備待測(cè)果汁樣品,LC-IRMS測(cè)定樣品中糖組分的δ13C值,研究結(jié)果顯示LC-IRMS分析方法可鑒定果汁的摻假問題。譚夢(mèng)茹等[107]根據(jù)LC-IRMS和EA-IRMS檢測(cè)分析蘋果汁中果糖、葡萄糖、二糖、寡糖、有機(jī)酸的δ13C,依據(jù)各個(gè)特征化合物的δ13C差值范圍,判斷蘋果汁是否摻雜了外源糖成分。由此可見,果汁的摻雜鑒定問題與蜂蜜摻雜判別標(biāo)準(zhǔn)相似,根據(jù)果汁的特征化合物δ13C值可鑒定果汁產(chǎn)品的真實(shí)性。

LC-IRMS技術(shù)還應(yīng)用于酒類和食醋的真假鑒定領(lǐng)域之中。李學(xué)民等[108]利用LC-IRMS檢測(cè)葡萄酒中甘油和乙醇的δ13C值,采用H+離子交換色譜柱分離甘油和乙醇成分,研究結(jié)果顯示葡萄酒中甘油和乙醇的δ13C值分別是-26.87‰～-32.96‰和-24.06‰～-28.29‰,兩者的δ13C值呈現(xiàn)正相關(guān)性,以此判定葡萄酒的摻雜問題。LC-IRMS還用于檢測(cè)白酒中乙醇的δ13C值,根據(jù)δ13C值信息判斷白酒真?zhèn)蝃109]。在食醋的真假鑒定方面,LC-IRMS主要用于分析食醋中的有機(jī)酸成分。李鑫等[110]采用反相Spursil C18色譜柱分析生物發(fā)酵來源乙酸和乳酸的δ13C值,以及工業(yè)合成來源乳酸的δ13C值,研究結(jié)果表明兩者之間有顯著性的差異,可用于食醋的真假鑒定領(lǐng)域。王奇等[111]利用LC-IRMS檢測(cè)山西和鎮(zhèn)江兩地生產(chǎn)的食醋中蘋果酸和乳酸成分,利用有機(jī)酸專用柱Prevail Organic Acid分離蘋果酸和乳酸,IRMS測(cè)定這兩種特征化合物的δ13C,將所得有機(jī)酸δ13C值數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,研究表明根據(jù)有機(jī)酸的δ13C值可鑒別山西和鎮(zhèn)江兩地來源的食醋。此外,還有學(xué)者運(yùn)用LC-IRMS檢測(cè)山西陳醋、鎮(zhèn)江香醋、白醋和米醋中乳酸與乙酸的δ13C值,反相親水的Zorbax SB-Aq色譜柱分離乳酸和乙酸特征化合物成分,單因素方差分析乳酸和乙酸的穩(wěn)定同位素?cái)?shù)據(jù),結(jié)果表明該檢測(cè)方法可鑒定食醋產(chǎn)品來源的真實(shí)性[112]。

LC-IRMS還應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和咖啡因等特征化合物的鑒定分析領(lǐng)域。李瀟等[113]利用LC-IRMS檢測(cè)乙醇的δ13C值,研制玉米和木薯來源乙醇的穩(wěn)定碳同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)品,探討LC-IRMS、GC-IRMS和EA-IRMS等不同技術(shù)的穩(wěn)定碳同位素比的測(cè)量準(zhǔn)確度;研究結(jié)果顯示LC-IRMS可應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制領(lǐng)域。我們的課題研究團(tuán)隊(duì)將LC-IRMS技術(shù)應(yīng)用于咖啡因的δ13C值的測(cè)定,反相Xbridge Shild RP C18色譜柱分離咖啡因等生物堿特征化合物成分,在較低的柱溫以及純水流動(dòng)相條件下,實(shí)現(xiàn)了特征化合物咖啡因的δ13C值測(cè)定[114]。

5 LC-IRMS的技術(shù)局限與挑戰(zhàn)

目前LC-IRMS在各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中有著一定的應(yīng)用與發(fā)展,但是該技術(shù)卻具有顯著的漏洞與不足。2011年Godin和McCullagh兩人[115]評(píng)述了LC-IRMS存在的技術(shù)局限性:(1)液相色譜與同位素比質(zhì)譜接口設(shè)備僅適合水性的流動(dòng)相,限制了LC-IRMS技術(shù)的應(yīng)用;(2)由于流動(dòng)相最大流速不能超過0.7 mL/min,導(dǎo)致了色譜分離保留時(shí)間比較長;(3)接口設(shè)備中濕法氧化反應(yīng)器的壽命與更換問題;(4)接口設(shè)備中磷酸酸化劑和過硫酸鈉氧化劑的泵缺少流量壓力表,無法實(shí)時(shí)顯示壓力,不利于故障排查問題?？傊?LC-IRMS技術(shù)具有一定的技術(shù)局限,整理歸納起來主要分為兩大技術(shù)問題,一是液相色譜使用條件的局限問題,二是樣品的穩(wěn)定同位素比檢測(cè)類型的單一問題,目前成熟的商品化LC-IRMS儀器僅僅適合于δ13C的檢測(cè)。

5.1 液相色譜使用條件的局限性

目前LC-IRMS主要適用于特征化合物δ13C的檢測(cè),要求液相色譜流動(dòng)相體系中不能含有碳成分,導(dǎo)致不能使用有機(jī)溶劑流動(dòng)相,極大地限制了液相色譜柱的選擇范圍,國內(nèi)外學(xué)者主要選擇離子色譜柱、糖柱及復(fù)合型色譜柱等類型的色譜柱,用于LC-IRMS特征化合物同位素分析領(lǐng)域之中,其中復(fù)合型色譜柱主要指SeLIC公司生產(chǎn)的Primesep系列規(guī)格的色譜柱[116],應(yīng)用最廣泛的反相C18色譜柱被排除在外,通常情況下不能用于LC-IRMS的檢測(cè)分析領(lǐng)域中。2008年瑞士學(xué)者Gold等[34]首次提出了采用升高溫度的方法,克服純水或水系緩沖液流動(dòng)相洗脫能力低的問題,但是也未將反相C18液相色譜柱應(yīng)用于LC-IRMS檢測(cè)之中。2011年Zhang等[55]改進(jìn)了高溫-液相色譜-同位素比質(zhì)譜(HT-LC-IRMS)分析技術(shù),突破了LC-IRMS不能使用反相C18色譜柱的限制性問題。我們的課題組研究表明,在較低溫度(55 ℃)色譜柱柱溫條件下,反相C18色譜柱也適用于LC-IRMS的穩(wěn)定同位素分析檢測(cè)領(lǐng)域之中[114,117]。

盡管反相C18色譜柱已經(jīng)可以應(yīng)用于LC-IRMS特征化合物同位素分析領(lǐng)域之中,但是僅僅限于親水性化合物,大量的疏水性化合物仍然被排除在外。由此可見,有待進(jìn)一步研究解決LC-IRMS存在的液相色譜使用條件的局限性問題。

5.2 穩(wěn)定同位素比測(cè)定類型的局限性

目前美國賽默飛公司生產(chǎn)的LC IsoLink接口設(shè)備和英國Isoprime公司的Liquiface接口設(shè)備均采用磷酸和過硫酸鈉濕法氧化還原的原理,將樣品中所有的碳成分轉(zhuǎn)化為CO2,進(jìn)行碳元素的δ13C檢測(cè),而常見的氮、氫和氧等輕元素不適用于當(dāng)前的LC-IRMS儀器設(shè)備。

為了克服LC-IRMS不能用于氮等其他元素同位素比測(cè)定的問題,國內(nèi)外科研工作人員進(jìn)行了相關(guān)的儀器研發(fā)工作。文獻(xiàn)報(bào)道顯示,2016年德國科研人員率先在實(shí)驗(yàn)室條件下,改造了LC與IRMS接口設(shè)備,在850 ℃高溫和Pt催化劑條件下,通入氧氣將目標(biāo)物的碳成分全部轉(zhuǎn)化成CO2氣體,接著在500 ℃溫度與Cu催化條件下,將目標(biāo)物的氮成分還原生成N2氣體,降溫冷卻分離氣體與液體,最終實(shí)現(xiàn)了LC-IRMS檢測(cè)樣品特征化合物的δ13C和δ15N值(見圖4)[118]。

總之,未來LC-IRMS技術(shù)的研究重點(diǎn)方向一是改進(jìn)與完善液相色譜分析條件,在現(xiàn)有的商業(yè)化LC-IRMS儀器設(shè)備基礎(chǔ)上,拓展到疏水性化合物δ13C的檢測(cè)領(lǐng)域中;二是改進(jìn)LC與IRMS接口硬件設(shè)備,使目前單一δ13C的測(cè)定擴(kuò)展到δ15N的檢測(cè),獲得更多更全面的特征化合物穩(wěn)定同位素信息數(shù)據(jù)。

圖 4 HPLC-IRMS特征化合物同位素分析的儀器系統(tǒng)配置圖[118]Fig. 4 System setup for compound specific isotopic analysis (CSIA) using HPLC-IRMS CSIA[118]

6 結(jié)論

LC-IRMS技術(shù)自開發(fā)以來,廣泛地應(yīng)用于食品真實(shí)性的鑒定及產(chǎn)地溯源、環(huán)境污染物的檢測(cè)、生命科學(xué)以及考古學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域之中,在非揮發(fā)性物質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素的研究領(lǐng)域,具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用價(jià)值。然而,LC-IRMS也存在流動(dòng)相體系中不含碳成分,色譜柱選擇范圍狹小等液相色譜使用條件的限制問題,以及穩(wěn)定同位素比檢測(cè)類型單一的技術(shù)局限問題。未來還需要進(jìn)一步改進(jìn)LC與IRMS接口設(shè)備,以及優(yōu)化液相色譜的分析條件,提高LC-IRMS特征化合物同位素分析技術(shù)的通用性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。