許展儀，朱根福

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州）

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎是一種以軟骨退變、滑膜炎癥、骨贅形成和軟骨下骨硬化為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病。其典型的體征和癥狀包括疼痛、腫脹和僵硬，常伴有功能減退和活動(dòng)受限[1]。這是一種進(jìn)展緩慢的致殘性關(guān)節(jié)紊亂，顯著降低了生活質(zhì)量。我國60歲及以上人群膝骨性關(guān)節(jié)炎的患病率為35%-50%[2]。盡管對(duì)OA的形成和發(fā)展的機(jī)制和病因進(jìn)行了廣泛的研究，但OA的病因仍不清楚。流行病學(xué)研究表明，OA是一種復(fù)雜的多基因疾病，有許多環(huán)境和遺傳危險(xiǎn)因素，其中導(dǎo)致疾病進(jìn)展的因素之一是遺傳成分[3]。在過去的15年里，研究的重點(diǎn)是尋找骨關(guān)節(jié)炎的易感部位?；蛐酒Y選出的差異表達(dá)基因，可用作早期診斷和靶向治療的生物標(biāo)記物[4]。目前，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)骨關(guān)節(jié)炎基因表達(dá)譜進(jìn)行了大量研究，篩選出數(shù)千個(gè)差異表達(dá)基因。然而，由于樣品的異質(zhì)性或測(cè)序平臺(tái)的不同，表達(dá)的mRNA的結(jié)果與不同的基因譜不一致。因此，在OA中還沒有確定可靠的結(jié)果。然而，集成的生物信息學(xué)方法將解決這些缺點(diǎn)，并確定參與OA的hub基因。

在本研究中，我們下載了微陣列數(shù)據(jù)集GSE117999[5]，并篩選出膝關(guān)節(jié)OA患者和正常對(duì)照組軟骨之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。應(yīng)用DEGS的GO和KEGG富集分析，構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的功能模塊分析。本研究旨在鑒定hub基因，探索OA發(fā)生的內(nèi)在分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 基因芯片原始數(shù)據(jù)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織基因芯片數(shù)據(jù)集為GSE117999，通過GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/）[6]下載得到，該數(shù)據(jù)集的平臺(tái)為：Agilent-072363 SurePrint G3 Human GE v3 8x60K Microarray 039494 [Feature Number Version]，該數(shù)據(jù)集為轉(zhuǎn)錄組表達(dá)芯片，共包括12例骨關(guān)節(jié)炎患者（GSM3316970、GSM3316972無表達(dá)數(shù)據(jù)）和12例無骨關(guān)節(jié)炎行關(guān)節(jié)鏡部分半月板切除術(shù)患者（GSM3316976、GSM3316980無表達(dá)數(shù)據(jù)）的軟骨組織。

1.2 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理和差異表達(dá)基因（DEGs）篩選 利用GEO2R在線分析工具[7]對(duì)數(shù)據(jù)集GSE117999進(jìn)行分析，其借助R語言（R3.2.3）軟件中Limma 3.2.8工具包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出差異表達(dá)基因，篩選條件設(shè)置為P<0.05，差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）≥1。利用DAVID中“Gene ID Conversion”對(duì)基因探針與基因庫中的基因名進(jìn)行匹配。

1.3 差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析 借助DAVID在線數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO富集分析[8]，其包括生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）3個(gè)方面的功能分析，以了解其相關(guān)功能。與此同時(shí)，本研究還利用KEGG在線數(shù)據(jù)庫（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析[9]，以了解骨關(guān)節(jié)炎軟骨病變中潛在的KEGG信號(hào)通路，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建和hub 基因篩選

通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）分析蛋白互作關(guān)系，該在線數(shù)據(jù)庫包含了5090個(gè)物種的2458萬蛋白質(zhì)[10]。借助可視化軟件Cytoscape 3.7.0（http://www.cytoscape.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[11]，使用CytoHubba插件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的hub基因分析，通過MCC、MNC、Degree這3種不同的算法構(gòu)建3個(gè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得分最高的前10個(gè)節(jié)點(diǎn)作為hub基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

與正常組相比，在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中共有85個(gè)DEGs，其中9個(gè)未能找到對(duì)應(yīng)的基因名稱，最終得到76個(gè)差異表達(dá)基因。其中上調(diào)的DEGs有33個(gè)，差異上調(diào)最明顯的包括ATP結(jié)合盒式亞家族B成員5（ATP Binding Cassette Subfamily B Member 5，ABCB5）、蛋白磷酸酶 6調(diào)節(jié)亞基 2（Protein Phosphatase 6 Regulatory Subunit 2，PPP6R2）、防 御 素 α3（Defensin Alpha 3，DEFA3）、精子尾部外密纖維 2樣（Outer Dense Fiber Of Sperm Tails 2 Like，ODF2L）、溶質(zhì)載體家族 3成員 1（Solute Carrier Family 3 Member 1，SLC3A1）；下調(diào)的 DEGs有 43個(gè)，差異下調(diào)最明顯的包括重組人序列相似性家族224成員A（Family With Sequence Similarity 224 Member A，F(xiàn)AM224A）、母系表達(dá)3（Maternally Expressed 3，MEG3）、軟骨素樣蛋白 2（Chordin Like 2，CHRDL2）、基質(zhì)金屬肽酶 3（Matrix Metallopeptidase 3，MMP3）等。見圖1。

2.2 基因功能富集分析

差異表達(dá)基因GO富集結(jié)果顯示，在分子功能中，差異表達(dá)基因主要涉及MHC II類受體活性、ATP酶活性；在細(xì)胞成分中，差異表達(dá)基因主要集中于反高爾基網(wǎng)絡(luò)膜、MHC II類蛋白復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分、核體；在生物過程中，差異表達(dá)基因主要與防御真菌、抗菌體液反應(yīng)、對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌的防御反應(yīng)、慢性炎癥反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)有關(guān)。見表1。KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集于產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、結(jié)核、移植物抗宿主病、同種異體移植排斥等信號(hào)通路。見表1。

表1 骨關(guān)節(jié)炎患者中差異表達(dá)基因本體、信號(hào)通路富集分析結(jié)果

2.3 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和hub 基因分析

分析結(jié)果通過3種不同的算法構(gòu)建了3個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)，得到了相似的結(jié)果。Cathelicidin抗菌肽（Cathelicidin Antimicrobial Peptide，CAMP）、防御素 α3（Defensin Alpha 3，DEFA3）、防御素α4（Defensin Alpha 4，DEFA4）在PPI網(wǎng)絡(luò)中的各項(xiàng)算法評(píng)分是最高的，并且這3個(gè)hub基因的表達(dá)都是上調(diào)的。見圖2。

圖2 骨關(guān)節(jié)炎軟骨中差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是世界上最常見的退行性疾病，影響大小關(guān)節(jié)。骨關(guān)節(jié)炎通常影響整個(gè)關(guān)節(jié)組織，包括滑膜、軟骨下骨和軟骨[12]?；ぱ资枪顷P(guān)節(jié)炎的共同特征，即使在早期疾病中也是如此。滑膜增生和組織肥大在晚期骨關(guān)節(jié)炎中有重要意義。越來越多的證據(jù)表明滑膜炎在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。進(jìn)一步了解骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)滑膜炎的分子和細(xì)胞變異性可以為關(guān)節(jié)炎的病因提供研究方向[13]。GEO數(shù)據(jù)庫基因芯片研究有助于確定遺傳因素在骨關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)中的重要作用。了解影響骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵基因?qū)?duì)于疾病的早期治療的發(fā)展是必要的。

本研究中，基因表達(dá)譜分析揭示了與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的hub基因和通路，并使我們能夠確定治療策略的靶點(diǎn)。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，與正常組相比，我們?cè)诠顷P(guān)節(jié)炎軟骨中識(shí)別出76個(gè)DEG，其中上調(diào)的DEGS有33個(gè)，下調(diào)的DEGS有43個(gè)。利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集結(jié)果，其主要涉及MHC II類受體活性、ATP酶活性；主要集中于反高爾基網(wǎng)絡(luò)膜、MHC II類蛋白復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分、核體；并且顯著富集于產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、結(jié)核、移植物抗宿主病、同種異體移植排斥等信號(hào)通路。在關(guān)節(jié)炎組織中還激活了免疫途徑，即同種異體移植排斥以及產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)，表明免疫反應(yīng)參與了這些疾病的發(fā)生。炎癥和細(xì)胞因子在RA和某些OA病例中起重要作用[14]。先天免疫反應(yīng)與軟骨的損傷存在著一定的關(guān)系，彼此的關(guān)系對(duì)OA的發(fā)展產(chǎn)生影響[15]。TLR增加IL-1β 和基質(zhì)金屬蛋白酶進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，加重OA的惡化程度[16]。

關(guān)節(jié)軟骨是一種結(jié)締組織，主要由細(xì)胞外基質(zhì)和透明軟骨細(xì)胞組成，細(xì)胞外基質(zhì)包括蛋白聚糖和膠原蛋白。正常軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，如果基因表達(dá)受到干擾并且平衡被打破時(shí)，將發(fā)生OA。本研究借助STRING在線數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析獲得了前10個(gè)HUB基因：CAMP、DEFA3、DEFA4、S100A8、ARGLU1、MMP3、TOLLIP、MSH2、ESR1、DUT。研究這些hub基因可能有助于膝骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷和治療?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）是一組內(nèi)肽酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白并具有同源結(jié)構(gòu)，參與軟骨破壞過程，從而參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。MMP-3作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員之一，主要由軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞分泌，不僅參與細(xì)胞外除多糖基質(zhì)以外的所有基質(zhì)的降解，還參與激活Ⅱ型膠原間質(zhì)膠原酶的降解，從而推動(dòng)軟骨的破壞，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程[17-18]。馮震[19]通過收集患者血液樣本分析得知雌激素受體α(ESR1)內(nèi)的rs2228480和rs2234693基因多態(tài)性與膝OA風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)；rs9340799和rs2228480之間的相互作用以及含有rs2228480-A和rs2234693-C等位基因的單倍型與膝OA風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。Toll作用蛋白（Toll-interacting protein, Tollip）是一種接頭蛋白，可在Toll樣受體（Toll like receptors, TLRs）信號(hào)通路中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，TLR被廣泛的病原體、細(xì)胞因子或其他特定分子激活，從而觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，進(jìn)而參與骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程[20]。IL-1刺激增加了軟骨細(xì)胞S100a8和S100a9 mRNA和蛋白質(zhì)水平，S100a8和S100a9的軟骨細(xì)胞mRNA表達(dá)在早期小鼠OA 中升高，而在晚期OA中則沒有。然而，與小鼠炎癥性關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞中的S100A8和S100A9兩者的陽性反應(yīng)相反，隨著小鼠OA的進(jìn)展，軟骨細(xì)胞中的S100A8染色消失。S100A8和S100A9在小鼠和人類骨關(guān)節(jié)炎期間積極參與滑膜激活和關(guān)節(jié)破壞的調(diào)節(jié)[21]。Neidlin M等通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）鑒定在四個(gè)關(guān)節(jié)組織中保存的基因模塊發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因（CSN1S1、APOD、FAP、COL5A2、MXRA5、DEFA3、DEFA4、S100A8）在其中 3個(gè)關(guān)節(jié)組織中差異表達(dá)[22]。本研究通過cytohubba插件分析發(fā)現(xiàn)一些新的與OA有關(guān)的基因，如DEFA3、DEFA4、MSH2等，可能作為 OA 潛在診斷和治療的靶點(diǎn)。

通過生物信息學(xué)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎數(shù)據(jù)集的分析，有助于確定骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的有用靶點(diǎn)和途徑。CAMP、DEFA3、DEFA4、S100A8、ARGLU1和MMP3等基因可能是調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要基因，這可作為骨關(guān)節(jié)炎診斷和治療靶點(diǎn)的研究提供新的思路的方向。本研究的局限性在于僅在生物信息學(xué)方面篩選的差異表達(dá)基因和分析分子機(jī)制，其需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。