師 帥,佟曉薇,韓盛旺,孫琦月,欒凱迪,朱紅奇,齊慧敏,馬祺昊,李虹霖△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

腦梗死在全球有較高的發(fā)病率和死亡率[1]，其中85%～87%為缺血性卒中[2]，與人類追求健康生活相背馳。研究表明腦缺血發(fā)生后若在梗死灶的缺血半暗帶有血供的恢復(fù)，則可明顯改善缺血區(qū)周圍的組織灌注，縮小腦梗死面積，重建血管微循環(huán)，使神經(jīng)功能快速修復(fù)[3]。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞的增值中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，并與血管新生有密切的聯(lián)系，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是血管新生相關(guān)通路Wnt/β-catenin中的效應(yīng)因子，在Wnt信號通路中，作為核心的β-catenin分子可以與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef結(jié)合，誘導(dǎo)cyclin D表達(dá)[4]，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。GSK-3β是糖原酶激酶的限速酶，參與了Wnt/β-catenin信號通路，其生物學(xué)作用與血管新生過程密切相關(guān)[5-6]。大量研究已經(jīng)證實(shí)，生長因子相關(guān)基因VEGF是Wnt/β-catenin信號通路的靶基因，梗死腦組織中若有VEGF的升高則可能有新生血管的生成。本實(shí)驗(yàn)通過頭穴圍刺結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法干預(yù)大腦中動(dòng)脈梗死(Middle cere-bral artery occlusion,MCAO)大鼠，觀察β-catenin、GSK-3β和VEGF蛋白水平的變化，探索其促進(jìn)血管新生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(260±20)g，75只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號SCXK(黑)2019001。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、頭穴圍刺組、運(yùn)動(dòng)組、圍刺+運(yùn)動(dòng)組，每組15只。按組別飼養(yǎng)于籠子中統(tǒng)一喂養(yǎng)由動(dòng)物中心配制的鼠糧和水，保持正常的12 h白天和黑夜交替周期。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 相關(guān)抗體 β-catenin(Cat.No.51067-2-AP);GSK-3β(Cat.No.22104-1-AP);VEGF(Cat.No.19003-1-AP);β-actin(60008-1-lg);Proteintech(武漢三鷹生物技術(shù)公司)。

1.2.2 PCR試劑盒 實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒：SYBR?Premix Ex TaqTM II(Perfect Real-time)(TaKaRa)；cDNA制備試劑盒：Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)。

1.2.3 PCR主要儀器 PCR熱循環(huán)儀(Applied Biosystems公司)；梯度PCR熱循環(huán)儀(Eppendorf公司)；超低溫冰箱(Thermo Scientific公司)；掌上離心機(jī)(Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)。

1.2.4 western blot試劑 蛋白酶抑制劑(Roche公司);丙烯酰胺(Amresco公司);甲叉(Amresco公司);過硫酸銨(Sigma公司);巰基乙醇(Sigma公司);PVDF膜(Merck Millpore公司);3M濾紙(Whatman公司);Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder(Fermentas公司);甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2.5 western blot儀器 高速臺式離心機(jī)(EP);熒光顯微鏡(Zeiss);恒溫水浴鍋(天津泰斯特公司);渦旋振蕩器(Thermolyne);紫外凝膠檢測盒成像系統(tǒng)(Bio-Rad);垂直板電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(BIO-RAD);Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Li-COR)。

ZH-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(徐州利華)。

1.3 模型制造及篩選方法

1.3.1 模型制造 MCAO模型的制備參照Zealand-Longa報(bào)道的線栓法[7]，大鼠測量體重后用10%的水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，在大鼠頸部正中的位置切約2 mm的切口，將右側(cè)頸總動(dòng)脈(Common carotid arternal,CCA)、頸內(nèi)側(cè)動(dòng)脈(Internal carotid artery,ICA)和頸外側(cè)動(dòng)脈(External carotid artery,ECA)分離。結(jié)扎ECA分支和CCA近心端，在CCA剪一細(xì)小切口并將線栓插入ICA，最后將線栓與CCA一并結(jié)扎，30 min后去除栓線并縫合。假手術(shù)組不插入栓線，術(shù)后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療，只予以同等條件抓取。其余各組均進(jìn)行MCAO制備。

1.3.2 篩選方法 術(shù)后大鼠清醒后采用Zea-longa神經(jīng)功能評分法進(jìn)行評分，無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)為0分；輕微局灶性神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展左前肢，提尾懸吊時(shí)左前肢屈曲為1分； 中度局灶性神經(jīng)功能缺損，爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，追尾為2分；重度局灶性神經(jīng)功能缺損，爬行時(shí)向左側(cè)傾倒為3分；不能獨(dú)立行走，意識障礙為4分。1～3分者為造模成功，可納入試驗(yàn)。

1.4 治療方法

1.4.1 頭穴圍刺組 造模后24 h進(jìn)行頭穴圍刺治療。根據(jù)大鼠針灸穴位定位法及擬人比照法定位，以病灶區(qū)即大腦中動(dòng)脈支配區(qū)為中心在其邊緣采用5根0.25 mm×13 mm的針灸針圍刺(穴位詳細(xì)說明：以百會(huì)穴為點(diǎn)向外側(cè)引1條1 cm的直徑做一圓周，5個(gè)進(jìn)針穴位中1個(gè)為百會(huì)穴其余在圓周上五等分的各點(diǎn)上)，針尖朝向圓心[8]。每日1次，30 min/次。每10 min捻轉(zhuǎn)1次。

1.4.2 運(yùn)動(dòng)組 造模后24 h，利用跑臺訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)治療(術(shù)前已經(jīng)經(jīng)過為期3天的適應(yīng)性訓(xùn)練，每天10 min)。時(shí)間:30 min/天；速度：1～3天8 m/min，4～7天12 m/min，7天后15 m/min;坡度:0°；1次/天[9]。

1.4.3 圍刺+運(yùn)動(dòng)組 造模后24 h在頭穴圍刺留針下進(jìn)行跑臺訓(xùn)練，每日1次，訓(xùn)練方法同頭穴圍刺組和運(yùn)動(dòng)組。

1.5 行為學(xué)評估

采用改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score，mNSS),mNSS行為學(xué)評分主要用于檢測小鼠運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡、反射等一系列能力，評分量表的分值由0～14分，分?jǐn)?shù)越高代表神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重[10]。各組小鼠于14天后進(jìn)行mNSS行為學(xué)檢測，并予以記錄。

1.6 腦梗死面積比

將腦組織置入-20℃冰箱中冷凍5 min后切成厚度為2 mm的5層冠狀切片，37℃避光下放入2%的TTC磷酸鹽緩沖液里30 min，染色成功后用4%多聚甲醛固定保存，此時(shí)，正常腦組織應(yīng)為紅色，梗死部分腦組織為白色。用數(shù)碼相機(jī)拍照后將圖像輸入計(jì)算機(jī)，利用Image-Pro Plus 5.1軟件進(jìn)行分析，使用校正后的 Swanson[11]方法計(jì)算梗死面積，計(jì)算公式：腦梗死面積比=(片健側(cè)總面積-片患側(cè)非梗死區(qū)面積)/二倍的片健側(cè)總面積×100%。

1.7 RT-PCR法檢測大鼠腦組織β-catenin mRNA和GSK-3β mRNA表達(dá)水平

用總RNA提取試劑盒提取腦梗死區(qū)腦組織總RNA，應(yīng)用Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書合成cDNA，選擇相應(yīng)引物擴(kuò)增基因，序列如下：β-catenin F-GGCAGCAACAGTCTTACCT，R-CATACAGGACTTGGGAGGT；GSK-3β F-GGGGCAACCTTAATTTCATT，R-GTGTCTGTATAACTGACTTC。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果照相保存。

1.8 Western Blot檢測VEGF蛋白表達(dá)

大鼠斷頭取腦，將組織勻漿裂解，離心去沉淀，取上層清液。按照BCA試劑盒要求測量蛋白質(zhì)濃度，取等濃度等體積上樣變性蛋白，SDS-PAGE(10%)電泳2 h后，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，一抗孵育過夜，VEGF(1∶1 000稀釋)，溫度保持4℃，TBST清洗膜5次×5 min，加入二抗(1∶8 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST清洗5次×5 min，用ECL顯色，于數(shù)字成像系統(tǒng)下顯影，采用Image J檢測條帶密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mNSS神經(jīng)功能缺損評分

治療14天后，與模型組相比，各治療組評分均低于模型組(P<0.01)；頭穴圍刺+運(yùn)動(dòng)組評分低于頭穴圍刺組和運(yùn)動(dòng)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表1。

2.2 腦梗死面積比

用TTC染色法可將大鼠正常腦組織染成紅色，梗死腦組織染成白色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，假手術(shù)組無腦梗死，其它各組均有不同程度的腦梗死，各治療組腦梗死面積比均小于模型組(P<0.01)；圍刺+運(yùn)動(dòng)組腦梗死面積比小于頭穴圍刺組和運(yùn)動(dòng)組(P<0.01)。結(jié)果見表1、圖1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積比比較

注：與模型組比較，aP<0.01；與圍刺+運(yùn)動(dòng)組比較,bP<0.01。

圖1 大鼠腦梗死面積(TTC染色)

2.3 血管新生相關(guān)蛋白β-catenin mRNA、GSK-3β mRNA表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，其它各組β-catenin mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組，圍刺+運(yùn)動(dòng)組表達(dá)高于頭穴圍刺組和運(yùn)動(dòng)組，P<0.05；與假手術(shù)組相比，GSK-3β mRNA表達(dá)只有模型組高于假手術(shù)組，其中圍刺+運(yùn)動(dòng)組表達(dá)最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠β-catenin mRNA、GSK-3β mRNA水平

2.4 VEGF蛋白表達(dá)

由圖3可知，假手術(shù)組、模型組、頭穴圍刺組、運(yùn)動(dòng)組和圍刺+運(yùn)動(dòng)組的灰度越來越大，其中頭穴圍刺組和運(yùn)動(dòng)組差異不明顯，圍刺+運(yùn)動(dòng)組的灰度最大，則表明VEGF表達(dá)最高。

圖3 各組大鼠VEGF蛋白表達(dá)

3 討論

頭針作為一種安全、有效的治療手段，一直廣泛地應(yīng)用于腦血管疾病的康復(fù)過程中，頭穴圍刺是《內(nèi)經(jīng)》中揚(yáng)刺的發(fā)展，是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在現(xiàn)代研究中的應(yīng)用，體現(xiàn)了傳統(tǒng)中醫(yī)近治作用的治療原則，圍刺頭部病灶處有助于改善病灶周圍的神經(jīng)代謝，有助于腦部神經(jīng)因子的生長，促進(jìn)受損細(xì)胞恢復(fù)，提高腦內(nèi)源性神經(jīng)生長因子的激活能力，促進(jìn)腦功能的恢復(fù)[12]。運(yùn)動(dòng)療法作用于功能障礙的肢體，通過重復(fù)性的動(dòng)作，反復(fù)刺激受損的中樞系統(tǒng)，提高腦功能及結(jié)構(gòu)的重建。頭穴圍刺與運(yùn)動(dòng)療法兩者共同作用可加快恢復(fù)腦功能。

血管新生是近年來研究的一個(gè)熱點(diǎn)，腦梗死發(fā)生后，重建缺血腦組織血流或是增加缺血區(qū)的血液供應(yīng)是修復(fù)受損腦組織的重要條件。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在炎癥反映的調(diào)控和促進(jìn)血管新生方面起重要的作用，其經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路是近年來公認(rèn)的與血管發(fā)生和新生密切相關(guān)的通路，關(guān)鍵分子是β-catenin，β-catenin分子水平受GSK-3β、Axin、APC和CK-1所形成的復(fù)合物控制，當(dāng)Wnt通路未激活時(shí)，β-catenin被GSK-3β所形成的復(fù)合物磷酸化，最終被蛋白酶降解。Wnt通路存在時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中Dsh被募集到細(xì)胞膜下，作用在GSK-3β復(fù)合物上使其不能形成，抑制β-catenin降解，使關(guān)鍵分子β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF結(jié)合，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[13-14],激活靶基因VEGF。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，腦缺血再灌注損傷模型大鼠在經(jīng)過頭穴圍刺治療、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和圍刺+運(yùn)動(dòng)治療均可改善大鼠的神經(jīng)功能障礙，縮小腦梗死面積，使血管新生相關(guān)蛋白β-catenin表達(dá)有所增多，進(jìn)一步抑制了GSK-3β復(fù)合物的形成，上調(diào)大鼠腦組織損傷區(qū)VEGF的陽性表達(dá),加速血管新生的生成。與頭穴圍刺組和運(yùn)動(dòng)組比較，圍刺+運(yùn)動(dòng)治療更加明顯的改善大鼠神經(jīng)功能障礙，有效縮小腦梗死面積，β-catenin表達(dá)明顯升高，更加明顯抑制GSK-3β生成，血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達(dá)明顯增多。而頭穴圍刺組與運(yùn)動(dòng)組相比各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上，圍刺+運(yùn)動(dòng)組治療的正向調(diào)節(jié)作用比單一頭穴圍刺和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練更強(qiáng)，提示圍刺+運(yùn)動(dòng)療法對腦缺血再灌注模型大鼠的血管新生機(jī)制的作用更明顯。筆者根據(jù)文獻(xiàn)資料推測在Wnt/β-catenin信號通路基礎(chǔ)上上調(diào)梗死區(qū)β-catenin蛋白表達(dá)、下調(diào)GSK-3β表達(dá)的同時(shí)作用于靶基因VEGF，可能為血管新生機(jī)制之一，下一步會(huì)更加深入研究此條通路對血管新生機(jī)制的影響，為圍刺+運(yùn)動(dòng)療法的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。