于建軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)是一種與遺傳、環(huán)境、神經(jīng)系統(tǒng)老化等因素相關(guān)的常見的神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙等特征性運動癥狀，亦有精神障礙、便秘、嗅覺障礙、睡眠障礙等非運動伴隨癥狀。其中精神障礙中的抑郁癥狀對患者生活質(zhì)量的影響比運動障礙更為嚴重。目前普遍認為40%～50%的PD患者合并抑郁[1]。抑郁癥狀會影響患者的治療效果，加重患者運動障礙，加重殘疾率,降低生活質(zhì)量。但帕金森抑郁(PDD)與原發(fā)性抑郁的發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)、對抗抑郁藥的反應不完全相同。PDD的發(fā)病機制尚不清楚，主流認為與內(nèi)源性生物學改變及外源性環(huán)境因素有關(guān)。本研究觀察電針刺激法對PDD模型大鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠120只，雌雄不拘，大鼠平均體質(zhì)量為(258.12±36.14)g，購入后在實驗室中飼養(yǎng)7天(保證每天12 h光照以及大鼠的正常飲水與攝食，保持清潔的飼養(yǎng)環(huán)境)，待大鼠適應新環(huán)境、狀態(tài)佳后開始實驗。

1.2 主要儀器及試劑

DA放免試劑盒、5-HT放免試劑盒、NE放免試劑盒(解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所)；0.25 mm×25 mm針灸針(貴州安迪藥械有限公司,安迪牌)；G6805-2A型電針治療儀(上海華誼儀器制造廠)。

1.3 造模方法

1.3.1 PD大鼠造模方法 對56只大鼠進行編號，隨機抽出12只做為空白組，剩余的44只均用于造模實驗。對造模組大鼠稱體重計算麻醉藥用量，采用常規(guī)方法麻醉，大鼠麻醉成功后利用腦立體定位儀獲取大鼠腦立體定向圖譜，確定大腦黑質(zhì)區(qū)位置后，鉆開顱骨，注射器確定靶向位后緩慢注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)。在術(shù)后2周，在大鼠腹腔注射阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)，計數(shù)40 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。記錄大鼠5 min向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)以及在40 min之內(nèi)發(fā)生旋轉(zhuǎn)的總次數(shù)[2]。而后對結(jié)果進行計算處理，每分鐘向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于7圈，且在40 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于280圈的大鼠認為是陽性大鼠，連續(xù)4周進行統(tǒng)分析，每周結(jié)果均符合上述要求的大鼠即為PD模型鼠。在本次造模試驗中44只大鼠中共36只大鼠造模成功。

1.3.2 PDD模型制作 待PD模型造模成功后，隨機抽出12只做為6-OHDA模型組，其余24只大鼠利用改進版的Winner慢性不可預見溫和應激法結(jié)合孤養(yǎng)法制造大鼠抑郁模型[3]。首先將用于造模的實驗大鼠單獨1個鼠籠飼養(yǎng)，而后通過不定順序的刺激導致大鼠出現(xiàn)應激障礙，其刺激條件包括全天禁食、全天禁水、4℃冷水游泳、懸尾、晝夜顛倒、行為限制以及電擊足底7種應激刺激，整個刺激周期為21天，每種刺激出現(xiàn)3～4次，但是保證1個刺激不能連續(xù)出現(xiàn)兩天，觀察大鼠的行為學變化并進行評價。

1.4 分組與處理方法

56只大鼠中隨機抽出12只做為空白組，在第1次造模成功的36只大鼠中隨機抽出12只做為6-OHDA模型組，將2次造模的24只大鼠分為2組:6-OHDA抑郁模型組12只、電針組12只。

電針組選用“百會”“印堂”“太沖”“三陰交”穴。根據(jù)實驗動物針灸穴位圖譜定位，“百會”透刺“印堂”穴，“印堂”穴向下平刺，“太沖”“三陰交”直刺進針，深度為8～10 mm，“百會”與“印堂”“太沖”與“三陰交”接G-66805型電針治療儀，設置電流強度為0.6 mA，頻率為2 Hz，待大鼠頭部和腳趾發(fā)生微顫定為針刺程度上限，電針時間為40 min，每日1次。治療周期為8周，從第5周開始觀察大鼠的行為學變化。其余3組不給予任何處置。

1.5 觀察指標與評價方法

1.5.1 動物行為學觀察指標與評價方法 評價方法主要包括懸尾試驗、糖水偏愛實驗以及強迫游泳實驗。其具體的評價方法[4]為:①懸尾試驗(Tail suspension test,TST)：大鼠尾巴固定于懸空橫桿上，保持大鼠與地面1.5 m高度，統(tǒng)計大鼠在每5 min內(nèi)的靜止時間，大鼠四肢與頭部相對不動，整個身體晃動的時間劃分到靜止時間。②糖水偏愛實驗(Sucrose preference test,SPT)：大鼠分籠后，在每個鼠籠中放置兩個飲水裝置，在實驗開始的第1天，在兩個容器中均放入含量為1%的蔗糖溶液，在實驗第2天，將其中1個容器中的蔗糖水更換成純凈水。而后禁食水1天，開始糖水消耗實驗檢測，同時給予大鼠等量的1%的蔗糖溶液以及純凈水，正常飼喂24 h后，計算糖水的消耗量，從而確定大鼠的糖水偏愛率，其計算公式為：糖水偏愛率=糖水消耗/綜合體消耗×100%。③強迫游泳實驗(Forced swimming test,FST)：在透明的玻璃缸中放置溫度23～25℃的溫水，放入實驗大鼠進行強迫游泳實驗，游泳時長為6 min，前兩分鐘由于大鼠剛接觸水環(huán)境的一系列應激性行為不計入統(tǒng)計，記錄后4 min大鼠漂浮不動的時間，大鼠靜止時間越長說明抑郁程度越大。在每只大鼠完成試驗后要對實驗用具進行統(tǒng)一的清理，避免影響下一只大鼠的檢測結(jié)果。

1.5.2 神經(jīng)遞質(zhì)檢測方法 大鼠行為學檢測實驗完成后，將大鼠麻醉處死，快速取出大鼠腦組織，將其進行保存。適時取冷凍保存的腦組織，制備腦組織勻漿樣本，4℃13 000 r/min 離心處理20 min后取上清液利用放射免疫測定方法檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學比較

與空白組比較，6-OHDA抑郁模型組大鼠的懸尾靜止時間與懸浮不動時間明顯延長，糖水消耗率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明6-OHDA抑郁模型組大鼠出現(xiàn)了行動緩慢、反應遲鈍、精神萎靡等抑郁表現(xiàn)。6-OHDA抑郁模型組與6-OHDA模型組各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電針組與6-OHDA抑郁模型組相比，大鼠懸尾靜止時間及懸浮不動時間縮短，糖水消耗率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明電針對帕金森抑郁大鼠的行為學有良好的改善作用。見表1。

表1 各組大鼠行為學比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P>0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

2.2 大鼠腦內(nèi)DA含量變化

與空白組比較，6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)DA含量均顯著降低(P<0.05)，結(jié)合行為學表現(xiàn)說明帕金森模型造模成功。6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電針組與6-OHDA抑郁模型組比較，大鼠腦組織中DA含量升高，經(jīng)檢驗差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明電針可使帕金森抑郁模型大鼠腦內(nèi)的多巴胺含量升高。見表2。

表2 大鼠腦內(nèi)DA含量變化

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P>0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

2.3 大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量變化

與空白組比較， 6-OHDA模型組、6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與6-OHDA模型組比較，6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明帕金森抑郁與5-HT與NE含量降低有相關(guān)性。與6-OHDA抑郁模型組比較，電針組大鼠腦組織中5-HT與NE含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明電針法可以提高帕金森病抑郁大鼠腦5-HT與NE的含量。見表3。

表3 大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量變化

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P<0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

3 討論

PDD是PD患者常伴發(fā)的非運動癥狀,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，有悶悶不樂、悲痛欲絕、自卑、悲觀厭世等情緒癥狀，嚴重者有幻覺、妄想等精神癥狀，因此可出現(xiàn)思維遲緩、缺乏主動性等表現(xiàn)。本研究的研究對象為無溝通能力的大鼠，因此無法表達自己的情緒與精神狀態(tài)，選擇慢性不可預見溫和應激(CUMS)法造模，因為刺激的不可預見性和多變性使之比較現(xiàn)實的模擬人在生活中所遭遇的各種困難。并且經(jīng)過長期多變和不可預見溫和應激之后，大鼠糖水消耗量的減少反映了抑郁的核心癥狀——對獎賞的反應性下降，即快感缺失[5]。模型引發(fā)的抑郁樣行為可持續(xù)數(shù)月,長期服用抗抑郁藥物可糾正并改善這些異常行為,是目前使用最為廣泛的模型[6]。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)屬于中樞神經(jīng)遞質(zhì)，對神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)有非常廣泛的調(diào)節(jié)作用，并對情感、情緒、應激行為等生理活動產(chǎn)生重要影響。其主要包括5-羥色胺(serotonin，5-HT)和兒茶酚胺(CA)。兒茶酚胺主要指多巴胺(Dopandne，DA)、腎上腺素(Adrenaline，A)和去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT、NE、DA 之間聯(lián)系緊密并且相互作用，三者的平衡失調(diào)是引起抑郁癥的重要原因[8]。5-HT是臨床上目前治療抑郁癥的重要靶向因子。腦內(nèi)5-HT系統(tǒng)的功能異常與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[9]。NE具有調(diào)節(jié)機體情緒、認知等生理功能。有研究表明NE通過去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體(Norepinephrine transporter，NET)的微調(diào)而發(fā)揮作用，在抑郁癥的發(fā)病中可能起著重要作用[10]。DA 作為NE的前體，參與心理應激活動及精神情緒活動，腦內(nèi)DA含量降低時就會出現(xiàn)情緒抑郁。

PDD在中醫(yī)理論中屬于“顫證”“郁證”合病的一種疾病類型，該病肝腎陰虧為本，風、火、痰、瘀為標，導致髓?？仗?、氣機郁滯，是本病產(chǎn)生的根本原因。王順教授通過30年針灸臨床與科研實踐，獨出機杼地提出“調(diào)神暢情三六九針法”[11-15]。調(diào)神暢情最早見于《北堂書鈔·卷一四二》曰:“安慮潤氣，調(diào)神暢情”，但書中未有詳載。王教授解釋為使精神順適、情緒歡暢。因在動物實驗過程中，考慮到針刺部位存在的局限性，故在“調(diào)神暢情三六九針法”中選取典型代表穴位進行針刺，百會為諸經(jīng)交會之要穴，又為督脈之大穴，“督脈入絡腦”與腦關(guān)系密切，所以人體之精氣可以通過百會散絡于腦。調(diào)節(jié)百會穴，可奉養(yǎng)元神，有健腦益髓、益心安神之功。印堂穴位于腦海前庭，為經(jīng)外奇穴，有安神定驚、醒腦開竅、寧心益智、疏風止痛、通經(jīng)活絡之功。太沖為足厥陰肝經(jīng)輸穴、原穴，具有疏肝理氣、通經(jīng)活絡、平肝熄風、清熱利濕之效。三陰交為足太陰脾經(jīng)腧穴，為肝脾腎三經(jīng)的交會穴，有補脾益腎調(diào)肝之功效。四穴相配，標本兼治，加強了醒神復常、健腦寧心、安神定志的功效。

本研究結(jié)果證實，與空白組大鼠相比,6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)DA含量均顯著降低(P<0.05)，結(jié)合行為學表現(xiàn)說明PD模型造模成功。6-OHDA抑郁模型組大鼠出現(xiàn)了行動遲緩、對事物興趣下降等變化，但電針刺激后，其懸尾靜止時間以及強迫游泳懸浮時間顯著縮短，且糖水消耗率升高，說明電針法能夠有效的緩解大鼠抑郁相關(guān)的行為學活動。與空白組、6-OHDA模型組相比，6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量均顯著降低(P<0.05)，說明PDD與5-HT和NE含量降低有相關(guān)性。這一結(jié)果與之前相關(guān)研究所證實的抑郁癥發(fā)病與5-HT以及NE等神經(jīng)遞質(zhì)的含量異常之間存在緊密聯(lián)系[16]的結(jié)果相符合。與6-OHDA抑郁模型組相比電針組大鼠腦組織中5-HT與NE含量升高，說明電針法可以提高PDD大鼠腦內(nèi)5-HT與NE的含量。

綜上，電針可使PD大鼠腦內(nèi)DA含量顯著升高、PDD大鼠腦內(nèi)5-HT與NE水平明顯升高，從而改善抑郁癥狀，值得在臨床中推廣。