王 銳，郭 麗，崔華峰，李永春，王長(zhǎng)春，李明妍，徐 敏

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是一種常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象，可引起心肌組織結(jié)構(gòu)、功能異常、大量細(xì)胞凋亡甚至心律失常的發(fā)生[1]，尤其是室性心律失常。據(jù)報(bào)道，心梗后溶栓或支架植入后，室性心律失常發(fā)生率可達(dá)80%[2]，是再灌注后猝死的主要原因。筆者基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)，以靈臺(tái)、神道、內(nèi)關(guān)、百會(huì)穴組成調(diào)心安神方，并施行特定的操作手法，治療早搏取得較好的療效[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該針?lè)蓽p少室性心律失常模型兔心肌細(xì)胞損傷，明顯縮短室性心律失常持續(xù)時(shí)間[4]。在此基礎(chǔ)上，筆者采用結(jié)扎/松解兔左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作RA模型兔，觀察調(diào)心安神針?lè)A(yù)處理對(duì)RA模型兔心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

健康家兔40只，雌雄各半，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，濟(jì)南西嶺角生物科技有限公司提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)20150001]。免疫組化一抗：兔抗Bcl-2和兔抗Bax(proteintech公司，貨號(hào)分別為12789-1-AP、50599-2-Ig)；廣譜二抗(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)D-3004);RIPA組織細(xì)胞快速裂解液(上?；鶢栴D生物科技有限公司，貨號(hào)BYL40825)；BCA蛋白定量試劑盒(thermo公司，貨號(hào)PICPI23223);Western印跡法檢測(cè)一抗：活性Caspase-3抗體(Abcam公司，貨號(hào)Ab2302)；GAPDH抗體(CST公司，貨號(hào)#5174)；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)A0208)。

1.2 分組及建模

40只家兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、胺碘酮組，每組10只。

再灌注性心律失常模型復(fù)制參照Reffelmann的方法。兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉，呼吸機(jī)導(dǎo)管連接氣管插管給予機(jī)械通氣，呼吸頻率30 r/min，吸呼比1∶1.5，通氣流量根據(jù)肺膨脹大小調(diào)整。開(kāi)胸，左冠狀動(dòng)脈前降支上、中1/3交界處穿線、結(jié)扎，立即監(jiān)測(cè)心電圖Ⅱ?qū)?lián)T波、ST段變化，以左室前壁發(fā)紺及心電圖ST段抬高≥0.5 mV為缺血標(biāo)志。結(jié)扎40 min后松開(kāi)硅膠管，恢復(fù)灌流60 min，抬高的ST段相對(duì)降低(>50%)，缺血區(qū)域心外膜顏色恢復(fù)紅潤(rùn)。連續(xù)記錄心電圖至手術(shù)完畢，取缺血區(qū)中央部位心內(nèi)膜心肌。

假手術(shù)組：穿線不結(jié)扎，靜置100 min。針刺組：造模7天前開(kāi)始給予調(diào)心安神針?lè)A(yù)治療，每天1次，共7天。針刺組和模型組第8天造模取材。胺碘酮組：于再灌注即刻泵入胺碘酮(3 mg/kg溶于生理鹽水5 mL中)，5 min泵入完畢。

1.3 針刺方法

參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸專業(yè)委員會(huì)制訂的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”取穴。靈臺(tái)、神道均向上斜刺5 mm，用震顫法快速小幅度行針1 min后起針；百會(huì)穴向后平刺5 mm；雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴分別直刺5 mm，行針1 min后接電針治療儀，疏密波，刺激強(qiáng)度以家兔上肢出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為度。百會(huì)、內(nèi)關(guān)留針20 min。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 Bcl-2、Bax蛋白檢測(cè) 將采集的心肌組織立即置于液氮停留約30 s使組織立即降溫、凍結(jié)，裝入自封袋中保存于-80℃冰箱。切片前將組織樣本置于-20℃冰箱內(nèi)復(fù)溫30 min，用OTC包埋膠包埋組織，置于冷凍切片機(jī)上，凍結(jié)后切片，切片厚度5～7 μm，1張用于HE 染色，2張用于免疫組化染色。于光學(xué)顯微鏡下400倍放大拍照, 顯微圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性表達(dá)面積。

1.4.2 活性Caspase-3檢測(cè) 將心肌組織剪成細(xì)小的碎片，加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解，4℃ 12 000 g離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并據(jù)此進(jìn)行PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，稀釋一抗抗體(活性Caspase-3 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000)，和膜室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，1∶1 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液顯色，以Tanon-5200成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色

假手術(shù)組：心肌組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)異常形態(tài)學(xué)改變;模型組：心肌組織可見(jiàn)明顯損傷，細(xì)胞排列紊亂、連接疏松。針刺組與胺碘酮組：心肌損傷較輕，部分心肌排列紊亂,細(xì)胞間輕度疏松溶解,可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞聚集；炎性細(xì)胞明顯減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HE染色

2.2 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

結(jié)果顯示，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)最低，假手術(shù)組最高，針刺組、胺碘酮組均較模型組明顯升高(P<0.01)，針刺組較胺碘酮組低(P<0.05)；模型組Bax蛋白表達(dá)最高，假手術(shù)組最低，針刺組、胺碘酮組均較模型組明顯降低(P<0.01)，針刺組與胺碘酮組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、封三彩圖2～3。

表1 各組Bcl-2、Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積比較

注：與模型組比較，△P<0.01；與假手術(shù)組比較，☆P<0.01；與胺碘酮組比較，※P<0.05，◎P>0.05。

2.3 活性Caspase-3表達(dá)比較

結(jié)果表明，模型組活性Caspase-3表達(dá)最高，假手術(shù)組最低，針刺組、胺碘酮組均較模型組明顯降低(P<0.01)，胺碘酮組較針刺組低(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖4。

表2 各組活性Caspase-3表達(dá)比較

注：與模型組比較，△P<0.01；與假手術(shù)組比較，☆P<0.01；與胺碘酮組比較，※P<0.01。

圖4 各組活性Caspase-3表達(dá)比較

3 討論

RA是缺血心肌再灌注后引起的損傷，與氧自由基、細(xì)胞間耦聯(lián)、鈣離子、自主神經(jīng)及體液系統(tǒng)等多種因素相關(guān)[5]。在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞凋亡對(duì)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能損害起著非常重要的作用。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)因素，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷[6]。

MIRI中細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制主要包括氧化損傷、影響線粒體功能和能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等[7]，Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白酶家族在線粒體途徑中起著關(guān)鍵作用。其中，Bcl-2 是重要的細(xì)胞凋亡抑制因子，Bax是重要的細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子，二者相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，通過(guò)改變線粒體膜的通透性和調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放，激活下游的半胱氨酸蛋白酶家族而誘導(dǎo)凋亡[8]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要效應(yīng)因子，能滅活諸多修復(fù)程序及抑制凋亡因子，是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最后執(zhí)行者。有研究證實(shí),急性心梗患者血清Caspase-3較健康人群顯著升高，對(duì)于AMI患者的診斷和預(yù)后有一定的臨床價(jià)值[9]。

免疫組化染色Bcl-2 和 Bax的陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞漿胞內(nèi)見(jiàn)為棕黃色區(qū)域。本研究中假手術(shù)組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)較多，而B(niǎo)ax和Caspase-3蛋白表達(dá)較少。RA發(fā)生后Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，而B(niǎo)ax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞凋亡參與缺血再灌注損傷過(guò)程。

胺碘酮為一種常用的高效抗心律失常藥物，可降低竇房結(jié)、浦肯野纖維的自律性和傳導(dǎo)性，有拮抗兔缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的作用[10]。本研究顯示，調(diào)心安神針?lè)A(yù)處理和胺碘酮干預(yù)后，RA模型兔心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax 、Caspase-3蛋白表達(dá)減少，表明二者對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，且胺碘酮作用較調(diào)心安神針?lè)ǜ鼮轱@著。

靈臺(tái)、神道穴均屬督脈，分別位于第6、5胸椎棘突下。《會(huì)元針灸學(xué)》曰：“靈臺(tái)者,……其兩旁為督脈之所系，陽(yáng)氣通其中，心靈居上，故名靈臺(tái)?！薄督?jīng)穴釋義匯解》中記載：“……為心氣之通道，主心疾，故名神道?！鼻叶矫}有一條分支入心中，故位于上焦處的靈臺(tái)、神道穴可以治療心臟疾患?，F(xiàn)代研究表明，背俞穴的分布規(guī)律與脊神經(jīng)節(jié)段性分布特點(diǎn)大致吻合。督脈穴、夾脊穴、背俞穴均位于背俞功能帶上，受相同神經(jīng)支配的各穴治療作用及作用機(jī)制大體相同[11]。認(rèn)為靈臺(tái)、神道穴對(duì)于早搏有相對(duì)特異性的治療作用[3]，在調(diào)心安神針?lè)ㄖ幸髢裳ǖ牟僮黜毩η笫贯樃邢蚯靶鼗騻?cè)胸部放散，即“氣至病所”。這種操作作用于軀體感覺(jué)神經(jīng)末梢及交感神經(jīng)末梢，通過(guò)神經(jīng)的軸突反射、節(jié)段反射途徑作用于脊髓相應(yīng)節(jié)段的植物神經(jīng)中樞，以調(diào)整心臟功能[11]。內(nèi)關(guān)屬手厥陰心包經(jīng)，為八脈交會(huì)穴之一，通于陰維脈，有寧心安神、鎮(zhèn)靜定痛、理氣和胃的作用，四總穴歌有“心胸內(nèi)關(guān)謀”之說(shuō)。研究表明，針刺內(nèi)關(guān)可增加心肌組織灌流量，改善末梢循環(huán)，糾正由于心肌缺血而誘發(fā)的心律失常[12]，減少了后除極電位和心律不齊的發(fā)生率[13]。而且，針刺內(nèi)關(guān)穴可促進(jìn)氧自由基清除[14]、減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[15]、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[16]、誘導(dǎo)保護(hù)性蛋白[17]等，從而達(dá)到對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)。百會(huì)為“五臟六腑奇經(jīng)之陽(yáng)，百脈之所會(huì)”，具升陽(yáng)舉陷、益氣補(bǔ)虛之力，可交通陰陽(yáng)、調(diào)節(jié)全身氣機(jī)[18]?！夺樉拇蟪伞份d百會(huì)穴：“主頭風(fēng)中風(fēng)……心煩悶，驚悸健忘，忘前失后，心神恍惚，無(wú)心力……百病皆治?！薄叭松碛兴难ㄗ顟?yīng)急……百會(huì)蓋其一也”，百會(huì)還是內(nèi)科急救常用穴之一。

綜上所述，調(diào)心安神針?lè)ㄍㄟ^(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax 、Caspase-3蛋白表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕缺血再灌注過(guò)程對(duì)心肌的損害，與以往的研究是一致的[19-20]，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。