趙雅欣，郭 豫，胡 芳，肖勁東

（1.北京聯(lián)合大學(xué)功能食品科學(xué)技術(shù)研究院，北京 100191；2.北京至元世恒醫(yī)藥研究中心，北京 100088）

0 引言

靈芝孢子油提取自靈芝孢子，集靈芝精華，富含靈芝孢子的有效成分，易被人體吸收利用，其保健功效成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-3]。現(xiàn)代研究表明，靈芝孢子油富含三萜類化合物、甾醇和不飽和脂肪酸，在神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、降血脂等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但關(guān)于靈芝孢子油抗氧化作用的研究尚且不多[4-5]。此外，相關(guān)研究多未表明所用靈芝孢子油的來源，而提取方式也會(huì)影響靈芝孢子油的有效成分及功效。有研究人員通過對靈芝孢子油提取方式的研究，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2流體萃取技術(shù)在保證安全和提取率的同時(shí)，能夠最大限度地保留靈芝孢子的活性成分[6-8]。因此，試驗(yàn)利用老齡小鼠模型，采用現(xiàn)代藥理學(xué)方法，明確使用超臨界CO2流體萃取技術(shù)進(jìn)行受試物提取，考查了靈芝孢子油的體內(nèi)抗氧化作用，旨在為靈芝孢子油在抗氧化方面的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

靈芝孢子油，淺黃色液體，鹽城市大豐葆康源生物科技有限公司提供；選用赤芝（Ganoderma lucidum）的破壁靈芝孢子，采用CO2超臨界萃取法提取，三萜含量達(dá)15 g/100 g以上。

1.1.2 動(dòng)物

SPF級8月齡KM種雌性小鼠[許可證號(hào)：SCXK-（京）2016-0011]，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；維持飼料[許可證號(hào)：SCXK（京） 2014-0010]，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.1.3 試劑

8-Isoprostane KIA Kit（酶聯(lián)免疫試劑盒），Cayman Chemical Company提供；SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、GSH試劑盒、MDA試劑盒、蛋白質(zhì)羰基試劑盒、雙縮脲蛋白試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 儀器

BS223S型電子天平、BS2202S型電子天平，賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司產(chǎn)品，3k15型高速離心機(jī)，德國Sigma公司產(chǎn)品；UV2600型紫外可見分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理（中國）有限公司產(chǎn)品；Elx808型酶標(biāo)儀，BioTek美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；SHH.W21.600C型恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與劑量

根據(jù)丙二醛的含量隨機(jī)將小鼠分成3組，每組10只。靈芝孢子油的人體推薦劑量為1.5 g/d（成人體重以60 kg計(jì)），小鼠灌胃劑量按人體推薦劑量的10，30倍設(shè)置，即設(shè)10倍組（250 mg/kgBW）、30倍組（750 mg/kgBW），另設(shè)空白對照組。

1.2.2 受試物配制及給予

根據(jù)試驗(yàn)劑量，用玉米油稀釋靈芝孢子油至適宜濃度（小鼠灌胃體積為10 mL/kgBW），空白對照組以玉米油為受試物，灌胃量相同。每日一次經(jīng)口給予，連續(xù)灌胃40 d。

1.2.3 指標(biāo)測定

依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局國食藥監(jiān)?；痆2012]107號(hào)附件1：抗氧化功能檢驗(yàn)方法，進(jìn)行以下指標(biāo)的測定，部分方法稍作修改。

（1）小鼠體重的測定。灌胃前后，分別測定小鼠體重并記錄。

（2）脂質(zhì)氧化產(chǎn)物測定。取血0.5 mL于室溫下靜置10 min，以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心10 min，取上清液待測；采用比色法，嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明，測定血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量。

小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min。取上清液，用EIA緩沖液稀釋15倍備用；嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明，測定血清中8-表氫氧-異前列腺素（8-Isoprostane）。

（3）蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物測定。取0.1 g組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加入0.9 mL冰的10 mmol/L HEPES緩沖液（pH值7.4），制成10%的勻漿。將勻漿液以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，保留上清液。取100 g/L的硫酸鏈霉素溶液50μL，加入上清液450μL（V/V，1∶9），室溫放置10 min后，以轉(zhuǎn)速11 000 r/min離心10 min，取上清液待測；嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明，測定肝組織中蛋白質(zhì)羰基。

（4）抗氧化酶活力測定。嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明，測定紅細(xì)胞抽提液中超氧化物歧化酶（SOD）活力；嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明，測定全血谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力。

（5）抗氧化物質(zhì)測定。取組織0.5 g加生理鹽水4.5 mL充分研磨成細(xì)漿（10%肝勻漿），混勻后取漿液0.5 mL加4%磺基水楊酸0.5 mL混勻，在室溫下以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，取上清液備用。嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明，測定肝組織中還原型谷胱甘肽（GSH） 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)全部表示為X±s，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以p＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)前小鼠血清丙二醛含量

給予受試物前小鼠血清MDA含量及給予受試物前后小鼠體重的變化情況見圖1。

圖1 給予受試物前小鼠血清MDA含量及給予受試物前后小鼠體重的變化情況

由圖1可知，試驗(yàn)前各劑量組老齡小鼠血清丙二醛含量與對照組比較，差異均無顯著性（p＞0.05）。小鼠分組的科學(xué)性直接影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，故選用專業(yè)機(jī)構(gòu)培育的試驗(yàn)小鼠，并遵循隨機(jī)分組原則，在試驗(yàn)前通過測定各組小鼠的血清MDA值來確定分組的科學(xué)性。由檢測結(jié)果可知，給予靈芝孢子油前老齡小鼠血清丙二醛含量在各組間較為均衡，符合隨機(jī)分組要求，具有分組科學(xué)性。

2.2 對小鼠體重的影響

由圖1可知，經(jīng)口給予老齡小鼠靈芝孢子油前及給予靈芝孢子油40 d后體重在各劑量組與對照組比較，差異均無顯著性（p＞0.05）。小鼠體重是小鼠是否健康的一個(gè)最基礎(chǔ)、最重要的衡量指標(biāo)。給予受試物前小鼠體重?zé)o顯著性差異，表明小鼠分組合理；給予受試物后各組小鼠體重?zé)o顯著性差異，說明該受試物對老齡小鼠的體重?zé)o不良影響，可推斷出該受試物不會(huì)對小鼠健康帶來不良影響，一定程度上說明靈芝孢子油具有較好的食用安全性。

2.3 對小鼠脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響

靈芝孢子油對小鼠血清MDA，8-Isoprostane含量的影響見圖2。

圖3 靈芝孢子油對小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量的影響

圖2 靈芝孢子油對小鼠血清MDA，8-Isoprostane含量的影響

由圖2可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對照組比較，高劑量組小鼠血清MDA含量降低，有顯著差異（p＜0.05）；小鼠血清8-Isoprostane含量無明顯變化（p＞0.05）。血清MDA和8-Isoprostane都是表明小鼠脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的指標(biāo)，但試驗(yàn)中出現(xiàn)了MDA含量降低但8-Isoprostane含量無明顯變化的情況，即靈芝孢子油在750 mg/kgBW劑量水平能降低老齡小鼠血清中的丙二醛含量，但靈芝孢子油對小鼠血清8-表氫氧-異前列腺素含量無顯著影響。這可能與2個(gè)指標(biāo)的敏感性有關(guān)，在灌胃40 d后小鼠血清MDA含量降低，也許更長時(shí)間才會(huì)引起小鼠血清8-Isoprostane含量的降低。趙灝等人[9]探討了靈芝孢子油對大鼠肝纖維化的影響，發(fā)現(xiàn)靈芝孢子油可顯著降低大鼠血清中MDA含量，與研究結(jié)果一致，說明靈芝孢子油具有降低體內(nèi)MDA含量的能力。

2.4 對小鼠蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響

靈芝孢子油對小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量的影響見圖3。

由圖3可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對照組比較，高劑量組小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量降低，有顯著差異（p＜0.05）。一些氧自由基會(huì)氧化蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)羰基產(chǎn)物的積累；一些自由基甚至?xí)?dǎo)致肽鏈斷裂，破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，同樣會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基。具有羰基的蛋白質(zhì)會(huì)聚集、交聯(lián)，從而失去應(yīng)有的活性，因此蛋白質(zhì)羰基含量是蛋白質(zhì)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。靈芝孢子油能夠降低小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量，這與靈芝孢子油較強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān)，說明其抗氧化作用能夠減少機(jī)體蛋白質(zhì)的氧化。結(jié)果表明，靈芝孢子油在750 mg/kgBW劑量水平能降低老齡小鼠肝組織中的蛋白質(zhì)羰基含量，有助于減緩機(jī)體的過氧化作用。靈芝孢子油使得老齡小鼠血清中的蛋白質(zhì)羰基的水平顯著降低，可以有效阻止一些自由基對蛋白質(zhì)的氧化作用；其他文獻(xiàn)中對靈芝孢子油和蛋白質(zhì)羰基的關(guān)系研究尚少。

2.5 對小鼠抗氧化酶活力的影響

靈芝孢子油對小鼠血中SOD和GSH-Px活力的影響見圖4。

圖4 靈芝孢子油對小鼠血中SOD和GSH-Px活力的影響

由圖4可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對照組比較，低、高劑量組小鼠血清SOD活力和GSH-Px活力均無明顯升高（p＞0.05）；即靈芝孢子油對老齡小鼠的血清過氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽過氧化物酶活力無顯著影響。SOD和GSH-Px是2種機(jī)體很重要的抗氧化酶，其活力高低標(biāo)志著機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱，給予靈芝孢子油后老齡小鼠的抗氧化酶活力并未提高，說明靈芝孢子油不能通過提高酶活力的方式來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。胡瞬等人[10]研究了靈芝孢子油對小鼠衰老模型的抗氧化作用，結(jié)果表明靈芝孢子油可顯著提高衰老小鼠血液中的過氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶活性。江紅梅等人[11]對輻射損傷老齡小鼠模型的研究也表明，靈芝孢子油對小鼠血液紅細(xì)胞的SOD活力有顯著提高的作用。但研究中，靈芝孢子油沒有顯著提高老齡小鼠的SOD活力，這可能與動(dòng)物模型、灌胃劑量等有關(guān)，胡瞬、江紅梅等人[10-11]選用的最大灌胃劑量均大于研究。

2.6 對小鼠肝組織還原型谷胱甘肽含量的影響

靈芝孢子油對小鼠肝組織還原型谷胱甘肽含量的影響見圖5。

由圖5可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對照組比較，肝組織GSH含量無明顯升高（p＞0.05）；即靈芝孢子油對老齡小鼠的肝組織還原型谷胱甘肽含量無顯著影響。還原型谷胱甘肽是肝組織中重要的抗氧化物質(zhì)，靈芝孢子油未能顯著提高其含量，說明靈芝孢子油不能通過提高肝組織還原型谷胱甘肽含量而間接地起到防止機(jī)體過氧化的作用。陳體強(qiáng)等人[12]不僅研究了靈芝孢子油中的脂溶性維生素，而且研究了靈芝孢子油的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)靈芝孢子油有明確的抗氧化活性。靈芝孢子油抗氧化的機(jī)理還可以做更進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

靈芝孢子油能顯著降低老齡小鼠的血清MDA含量和肝組織蛋白質(zhì)羰基的水平，說明靈芝孢子油能夠減少小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物，具有顯著的抗氧化作用。但是，靈芝孢子油并不能有效提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的活力或含量，這說明靈芝孢子油應(yīng)該是直接跟氧自由基等活性氧作用，從而保護(hù)機(jī)體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)不被氧化，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。關(guān)于靈芝孢子油與其抗氧化作用的量效關(guān)系及確切機(jī)制，還有待更進(jìn)一步研究。