王藝芳,葛文超,李俊英,李建斌,方建華

（河南省紅十字血液中心檢驗科，河南 鄭州 450012）

《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》明確提出：要完善無償獻血服務(wù)體系,加強血站血液安全保障能力建設(shè)，積極推進血站核酸檢測工作，提高血站實驗室檢測能力。2015年，河南省還沒有全面開展核酸檢測，在河南省衛(wèi)計委協(xié)調(diào)下，由河南省紅十字血液中心、洛陽市中心血站、焦作市中心血站3個核酸檢測實驗室承擔全省18家血站核酸檢測任務(wù)。血液中心檢驗科核酸檢測實驗室承擔了7家地市級中心血站的核酸集中化檢測工作，實現(xiàn)了2015年底核酸檢測全覆蓋?，F(xiàn)將一年來的集中化檢測工作報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2015年10月-2016年12月31日省血液中心和七家中心血站采集的358923例經(jīng)2種不同廠家的試劑進行2遍ELISA檢測HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2均無反應(yīng)性的無償獻血者標本。獻血者均符合國家《獻血者健康檢查要求》（GB-2012）要求。采集血液時留取用于ELISA和NAT檢測的標本,其中NAT標本在采樣后4h內(nèi)于2~8℃的低溫離心機以1760g離心20min，離心后2~8℃臨時保存，并在4h內(nèi)運到實驗室。標本運輸和保存完全按照 《血站技術(shù)操作規(guī)程2015版》中相關(guān)要求進行操作。

1.2 主要試劑和儀器 科華核酸檢測系統(tǒng)：NAT試劑（上?？迫A生物工程股份有限公司），試劑批號：20151013、20151114、20151115 等, 配套耗材由試劑公司提供，均在有效期內(nèi)使用。Hamilton Star全自動混樣儀(瑞士HAMILTON公司),ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）,低溫大容量離心機KUBOTA 8730（日本KUBOTA公司）。

1.3 實驗方法 去除酶免檢測HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2雙試劑陽性的標本，采用科華核酸檢測系統(tǒng)先進行HBV/HCV/HIV核酸定性8混樣檢測，混樣檢測陽性再進行拆分檢測,實驗操作嚴格按儀器和試劑盒說明書進行。結(jié)果判定：混樣有陽性而拆分陰性的標本則判為NAT陰性,混樣有陽性拆分也有陽性的標本則判為NAT陽性。

1.4 質(zhì)量控制 標本和試劑的運輸和保存完全按照《血站技術(shù)操作規(guī)程2015版》中相關(guān)要求進行操作。標本檢測全過程由試劑盒的質(zhì)控品和室內(nèi)質(zhì)控品對實驗進行有效控制。本實驗室定期參加國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心組織的室間質(zhì)量評價活動和CITIC血液篩查室間質(zhì)評項目。

1.5 集中化檢測模式 7個中心血站的NAT標本均是經(jīng)過兩遍ELISA檢測過的標本(雙陽性除外)。省血液中心和7個中心血站分別簽訂了 《委托檢驗協(xié)議書》明確了血液集中化檢測機構(gòu)間的權(quán)利和義務(wù),規(guī)定了各集中化檢測機構(gòu)進行相應(yīng)的血液及標本的采集、運送，移交，檢測、檢驗結(jié)果的發(fā)送與接收等內(nèi)容。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAT檢測結(jié)果 對ELISA檢測陰性（酶免雙試劑陽性標本除外）的其中358 923例標本進行NAT結(jié)果，見表 1、表 2,共檢出 286例 HBV DNA+、1例HCV RNA+和9例HIV RNA+。總的NAT陽性率為0.82‰，總的NAT結(jié)果無效率0.22%，總的NAT拆分陽性率61.16%。E血站NAT陽性率最高(2.06‰),B血站次之(1.41‰),最低為血液中心（0.46‰）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A 血站 NAT 結(jié)果無效率最高（0.57%）,其次是 G 血站（0.34%），血液中心最低（0.07%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。E血站NAT拆分陽性率最高 （77.91%），A血站次之（74.07%），F(xiàn) 血站最低（49.37%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.2 每月NAT陽性率、NAT結(jié)果無效率和NAT拆分陽性率 每個月的NAT陽性檢出率前期平均在0.94‰，后期則比較平穩(wěn),見圖1。NAT結(jié)果無效率前期較高，后期降低，整體呈下降趨勢,見圖2。NAT拆分陽性率則大部分維持在50~72%（8月份例外），只有最后兩個月較低25~35%,見圖3。

表1 集中化核酸檢測結(jié)果（n=358 923）

表2 集中化核酸檢測結(jié)果核酸檢測陽性項目類型（n=358 923）

圖1 2015年-2016年每月NAT陽性檢出率

圖2 2015年-2016年每月NAT無效率

3 討論

病毒核酸檢測技術(shù)（NAT）是直接檢測病原體核酸的一系列技術(shù)的總稱,相比血清學(xué)抗原抗體檢測方法（EIA），血液病毒核酸檢測技術(shù)可以有效縮短抗原抗體免疫檢測的“窗口期”，從而大大降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險[1,2]。雖然，從理論上NAT并不能完全消除病毒感染的窗口期,但可以有效地預(yù)防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病[3]。

圖3 2015年-2016年每月NAT拆分陽性率

科華核酸檢測系統(tǒng)在2015年10月-2016年12月共檢測了358923例標本,其中納入集中化檢測的7個中心血站標本259342例，占72.25%。從表1可以看出7個血站以及血液中心之間NAT陽性率、NAT無效率、拆分陽性率有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NAT總陽性率0.82‰，也高于該試劑實驗室之前報道的0.30‰[4]，略高于上海0.63‰[5]和西安0.66‰[6]，低于上饒 2.60‰[7]、 杭州 2.00‰[8]、 合肥1.62‰[9]和烏魯木齊 1.10‰[10]，南京 0.94‰[11]。 其中E血站NAT陽性率最高 （2.06‰），B血站NAT陽性率1.41‰次之,血液中心NAT陽性率0.46‰最低。分析原因可能是：7個血站的標本全部送到血液中心集中檢測,各個單位血液篩查實驗室的酶免檢測HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2所用試劑、酶免設(shè)備和人員操作水平以及不同地區(qū)流行病學(xué)特點也不盡相同，可能在某種程度上提升了NAT陽性率。因此對于不同地區(qū)獻血者人群中HBV/HCV/HIV病毒感染差異性的現(xiàn)象及原因，有待進一步探討。

在集中化期間,每個月的NAT陽性率前8個月平均在0.94‰,后5個月則比較平穩(wěn),見圖1。N AT無效率前6個月較高，后幾個月降低，整體呈下降趨勢（見圖2），可能與前期送檢標本的質(zhì)量和設(shè)備的超負荷遠轉(zhuǎn),直接影響了核酸檢測結(jié)果的有效性。NAT拆分陽性率則大部分維持在50～72%（8月份例外）,只有最后兩個月較低25～35%（見圖3）。通過對這些質(zhì)量監(jiān)控指標的分析，筆者發(fā)現(xiàn)了實驗室在集中化檢測期間的一些問題：集中化檢測期間,標本量的驟增使實驗室和人員的超負荷工作運轉(zhuǎn)以及機器設(shè)備不能得到良好的維護和保養(yǎng),這有可能是造成每月NAT陽性檢出率和拆分率要比之前實驗室報道略高[4]的原因。國內(nèi)外的報道也表明，核酸檢測過程中存在假反應(yīng)性現(xiàn)象[12-14]，原因可能是一定的實驗室污染導(dǎo)致非特異性擴增，防污染是核酸檢測必須重視的重要問題[12]。另外,在集中化最初也發(fā)現(xiàn)了一些影響血液檢測質(zhì)量的一些疏漏環(huán)節(jié),如由于送檢單位之前從未進行NAT標本的采集和送檢,送檢標本標簽的粘貼不規(guī)范，標本出現(xiàn)溶血、脂血以及量不足等諸多標本質(zhì)量問題影響血液檢測。通過和各送檢單位溝通和培訓(xùn)，建立統(tǒng)一的標本質(zhì)量標準后，標本質(zhì)量得以解決。

實施集中化檢測后，全面開展血液核酸檢測，最大限度的保障了集中化檢測區(qū)域內(nèi)所有血站的血液質(zhì)量安全[15]。目前河南省境內(nèi)集中化檢測任務(wù)已經(jīng)結(jié)束，中心血站都建立了各自的NAT實驗室。但是，每個血站僅有一個NAT實驗室和一套NAT設(shè)備，若遇實驗室污染或緊急情況時，沒有備用實驗室，勢必會造成結(jié)果無法按時發(fā)布，血液不能及時發(fā)往臨床。故筆者建議，將河南省內(nèi)所有中心血站(包括血液中心)NAT實驗室結(jié)合實驗室場地、設(shè)備類型、人員、信息系統(tǒng)、地域位置、血站現(xiàn)狀等實際情況進行綜合評估，選出信息對接方便、設(shè)備運行良好、人員資質(zhì)較高和交通便利的NAT實驗室作為其他地區(qū)的互助實驗室,實行優(yōu)勢資源互補。

本血液中心承擔的7家血站核酸集中化檢測任務(wù),利用了血液中心運行相對成熟的核酸實驗室,并在規(guī)定時間內(nèi)完成集中化地區(qū)核酸檢測的全覆蓋，有效防止了病毒經(jīng)血液傳播，保障了區(qū)域內(nèi)的血液安全。此次核酸集中化檢測各家血站的數(shù)據(jù)信息可以為其后期開展核酸檢測作為參考。