馬妮薩

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院集中采血室，河南 洛陽 471003）

流行病學(xué)研究證實(shí),我國部分地區(qū)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的發(fā)病率可達(dá)284~569/10萬人左右[1]。臨床上NSCLC的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊邿o瘤生存時(shí)間和總體生存時(shí)間的下降,導(dǎo)致患者短期內(nèi)病死風(fēng)險(xiǎn)的上升[2]。在揭示NSCLC的病情進(jìn)展機(jī)制的過程中，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)因子的改變，能夠影響到肺泡上皮細(xì)胞的異型性,影響到癌細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC的病情進(jìn)展。正五聚蛋白3（PTX3）是上皮細(xì)胞炎癥、免疫和腫瘤相關(guān)因子，其能夠通過影響到炎癥性細(xì)胞的浸潤，加劇氧化應(yīng)激性反應(yīng)的激活,進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞的異常病變，提高惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]；賴氨酰氧化酶樣蛋白2（LOXL2）的表達(dá)改變，能夠通過影響到金屬基質(zhì)蛋白酶的活性,加劇癌細(xì)胞間質(zhì)成分的分解，進(jìn)而為癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移等提供基礎(chǔ)[4]。部分研究者探討了PTX3在生殖系統(tǒng)腫瘤或者消化系統(tǒng)腫瘤患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為PTX3的表達(dá)上升與相關(guān)腫瘤的發(fā)生有關(guān)[5],但缺乏對(duì)于PTX3、LO XL2的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系研究。為了揭示PTX3、LOXL2的表達(dá)與NSCLC的病情關(guān)系,從而為臨床上NSCLC患者的病情評(píng)估提供參考,本研究選取我院2013年1月至2014年12月收治的90例NSCLC患者,探討了PTX3、LO XL2的表達(dá)及其與患者病情的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2013年1月至2014年12月收治的90例NSCLC患者為NSCLC組、同期健康體檢對(duì)象90例為對(duì)照組。

NSCLC組，年齡 48~77歲，平均 63.6±8.2歲，男54例、女36例，病理學(xué)分化程度：高分化23例、低分化34例、中分化33例；病理學(xué)類型：鱗癌29例、腺癌61例；腫瘤病灶大?。骸?cm 27例、<5cm 63例；TNM分期：Ⅰ期25例、Ⅱ期32例、Ⅲ期27例、Ⅳ期6例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。對(duì)照組，年齡 46~77歲，平均 62.9±10.0歲，男 51例、女39例。2組研究對(duì)象的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴NSCLC患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《外科學(xué)》人民衛(wèi)生出版社第八版中的標(biāo)準(zhǔn)；⑵均為首次檢出肺癌的患者，在獲取患者肺癌組織、癌旁組織、血清樣本前，患者未接受放化療及免疫治療；⑶患者年齡≤79歲；⑷本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)、研究對(duì)象的知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴轉(zhuǎn)移性肺癌；⑵其他部位惡性腫瘤；⑶風(fēng)濕類、結(jié)締組織疾??；⑷伴有其他類型疾病。

1.2 免疫組化染色方法及判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用石蠟進(jìn)行連續(xù)性切片,脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗 3 次，每次 3～5min，8%的蛋白粉封閉液（商品名：BSA購自南京博奧生物科技公司），封閉2h，倒去封閉液后加入一抗（兔來源 濃度 1：1000～1500），4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入二抗（鼠來源 1：400～500），室溫孵育 20～30min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標(biāo)記物，室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，滴加顯色劑（DAB購自南京博奧生物科技公司），復(fù)染，脫水，封片。

免疫組化結(jié)果判定：LOXL2蛋白的陽性著色表達(dá)于細(xì)胞核，呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，⑴根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；⑵根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%為1分、陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分、陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽性細(xì)胞數(shù)所占比例＞75%為4分，兩種積分相乘總分＜3分為陰性、≧3分為陽性。總分＜3分：“-”表達(dá)；為 3～5 分，“+”表達(dá)。

1.3 ELISA檢測 采集患者的靜脈血3ml,加入PT X3單抗,標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的PTX3會(huì)與單抗結(jié)合,PBS液體洗滌5min。按照1：500的比例加入羊標(biāo)志的一抗 5ml，4℃放置過夜，PBS緩沖液洗滌 3次，每次 5min，加入鼠來源的二抗（1：1000）2ml，室溫放置2h，PBS液體洗滌5min。加入顯色底物,辣根過氧化物酶會(huì)使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色,加終止液變黃。在450nm處測OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)表述采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS16.0版本。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中LOXL2蛋白表達(dá)比較 NSCLC癌組織中的LOXL2蛋白陽性表達(dá)率76.67%顯著的高于癌旁組織的15.56%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；見表 1。

2.2 NSCLC患者血清PTX3水平比較 NSCLC癌患者血清PTX3水平顯著的高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＜0.05）；見表 2。

表1 NSCLC組織中LOXL2蛋白表達(dá)比較

表2 NSCLC患者血清PTX3水平比較（x±s）

2.3 NSCLC患者LOXL2蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 NSCLC癌患者癌組織中的LOXL2蛋白表達(dá)與患者TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；見表 3。

表3 NSCLC患者LOXL2蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[n（%）]

2.4 NSCLC患者血清PTX3水平與患者病理學(xué)特征的關(guān)系 在不同分化程度、病理學(xué)類型、病灶大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC癌患者血清PTX3水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；見表4。

2.5 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 90例NSCLC患者，獲得隨訪的有81例，3年生存率為23.33%（21/90）,采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示：TNM分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LOXL2蛋白陽性表達(dá)與患者的不良預(yù)后直接相關(guān)，是獨(dú)立性危險(xiǎn)因素，P＜0.05；見表 5。

表4 NSCLC患者血清PTX3水平與患者病理學(xué)特征的關(guān)系（x±s）

3 討論

長期吸煙、環(huán)境污染或者家族性的遺傳易感基因的攜帶，均能夠促進(jìn)NSCLC的發(fā)生，特別是在合并有顯著的相關(guān)家族史的患者中，NSCLC的發(fā)病率可進(jìn)一步的上升[6]。臨床上NSCLC的發(fā)生不僅能夠?qū)е禄颊叨唐趦?nèi)高腫瘤負(fù)荷臨床表現(xiàn)的出現(xiàn)，同時(shí)還能夠?qū)е禄颊哌h(yuǎn)期生存轉(zhuǎn)歸的惡化[7]?，F(xiàn)階段臨床上缺乏對(duì)于NSCLC患者病情轉(zhuǎn)歸的可靠性評(píng)估指標(biāo),雖然血清中CA125等能夠在NSCLC的臨床預(yù)后評(píng)估過程中發(fā)揮作用。但單純依靠CA125評(píng)估NSCLC患者臨床預(yù)后轉(zhuǎn)歸的靈敏度不足45%，評(píng)估的一致性率不足30%[8]。而本研究對(duì)于NSCLC患者體內(nèi)不同生物學(xué)指標(biāo)的探討，不僅能夠揭示NSCLC的病情進(jìn)展機(jī)制，同時(shí)還能夠?yàn)榕R床上NSCLC的臨床預(yù)后的評(píng)估提供血清學(xué)方面的參考。

表5 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果

PTX3是炎癥調(diào)控性相關(guān)指標(biāo)，其能夠通過影響到上皮細(xì)胞的核異型性,提高炎癥性因子和氧化應(yīng)激性因子對(duì)于上皮細(xì)胞的浸潤,進(jìn)而導(dǎo)致上皮細(xì)胞核異常裂變的發(fā)生。基礎(chǔ)方面的研究還認(rèn)為，PTX3的表達(dá)上升能夠?qū)е律掀ぜ?xì)胞基因錯(cuò)配修復(fù)能力的下降，導(dǎo)致癌細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄過程的顯著激活[9]；LOXL2是氧化酶家族成員，其能夠通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)過程轉(zhuǎn)化，進(jìn)而加劇上皮細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，提高癌細(xì)胞的浸潤深度。LOXL2的表還能夠通過促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶-9的激活,提高了癌細(xì)胞間質(zhì)成分的降解,導(dǎo)致癌細(xì)胞間粘附能力的顯著下降，促進(jìn)了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程[10]。部分研究者探討了PTX3的表達(dá)與肺癌患者的病情關(guān)系,認(rèn)為PT X3的表達(dá)上升與NSCLC患者的病情進(jìn)展密切相關(guān)[11]，但缺乏對(duì)于LOXL2的表達(dá)與NSCLC的病情關(guān)系研究。

本研究對(duì)于NSCLC患者體內(nèi)LOXL2、PTX3的表達(dá)分析研究可見,在病例組患者中，LOXL2、PT X3的表達(dá)濃度均顯著的上升，高于正常對(duì)照組人群，差異較為顯著，提示了LOXL2、PTX3的表達(dá)均能夠參與到NSCLC的病情進(jìn)展過程。通過匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn),筆者認(rèn)為這主要由于LOXL2、PT X3的下列幾個(gè)方面的作用機(jī)理有關(guān)[12-15]：⑴LOXL2的表達(dá)上升能夠提高snail蛋白的激活,提高了其誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程,促進(jìn)了癌細(xì)胞的浸潤和侵襲過程；⑵PTX3的表達(dá)上升，能夠通過提高氧化應(yīng)激性因子對(duì)于癌細(xì)胞的浸潤,導(dǎo)致癌細(xì)胞核異型性的突變。黃誠文等[9]研究者也認(rèn)為，在肺癌患者病灶組織中，PTX3蛋白的表達(dá)陽性率可平均上升30%以上,特別是在具有顯著的惡病質(zhì)或者腫瘤消耗性表現(xiàn)的患者中，PTX3蛋白的表達(dá)陽性率可進(jìn)一步的上升。在探討LOXL2、PTX3的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系過程中,可以發(fā)現(xiàn)在臨床分期較晚或者合并有顯著的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，LOXL2的表達(dá)濃度均顯著的上升,提示LO XL2的表達(dá)與肺癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)，這主要由于LOXL2的表達(dá)上升能夠提高癌細(xì)胞對(duì)于臨近正常肺泡組織的浸潤,導(dǎo)致癌細(xì)胞的擴(kuò)散和累及范圍的增加。但本研究中并未發(fā)現(xiàn)PTX3的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系,存在不同的臨床結(jié)論，考慮可能與PTX3蛋白的檢測方法或者肺癌患者的基礎(chǔ)性病情的差異有關(guān)。危險(xiǎn)因素分析研究也可見，TNM分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LOX L2蛋白陽性表達(dá)與患者的不良預(yù)后直接相關(guān)，進(jìn)一步提示了LOXL2蛋白的表達(dá)與肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系,臨床上可以通過隨訪LOXL2蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而評(píng)估肺癌患者的臨床轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，在NSCLC患者中，LOXL2、PTX3的表達(dá)均明顯上升，LOXL2的表達(dá)與NSCLC的臨床病理特征或者臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。