謝慶超，張紅敏，劉海泉，王錫昌，潘迎捷，趙勇,4*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(上海)；3.上海海洋大學(xué)食品質(zhì)量安全檢測實(shí)驗(yàn)室；4.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心: 上海201306)

生食水產(chǎn)品營養(yǎng)物質(zhì)種類全面、風(fēng)味獨(dú)特，贏得不少消費(fèi)者的青睞。近年來人們的食品安全意識日漸增強(qiáng)，因此，生食水產(chǎn)品的安全問題也逐漸受到重視。生食水產(chǎn)品以海產(chǎn)品為主，而根據(jù)來源海產(chǎn)品又可分為近海產(chǎn)品和外海產(chǎn)品。有研究表明，近海生食水產(chǎn)品如三文魚(Oncorhynchus)、牡蠣(Ostreagigasthunberg)、北極貝(Pseudocardiumsachalinense)、扇貝(Pectinidae)、甜蝦(Pandalusborealis)、壽司蝦(Penaeuschinensis)、海膽(Echinoidea)和蘭花蚌(Pseudocardiumsachalinense)等更易受生物及化學(xué)性污染[1]。其中，近海生食水產(chǎn)品引起的腸胃炎等各類食源性疾病[2-5]的主要病因是食源性病原微生物，如副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，簡稱Vp)[6]等。Vp是一種廣泛存在于水產(chǎn)品中的海洋細(xì)菌及人類病原菌，在熱帶和溫帶的沿海環(huán)境中，尤其是在溫度較高時，Vp易附著或者侵入浮游動物、魚類和貝類等水產(chǎn)品中。以牡蠣為例，其作為近海養(yǎng)殖的海產(chǎn)品，產(chǎn)量位于中國海水養(yǎng)殖產(chǎn)品首位，2018年產(chǎn)量達(dá)500余萬 t[7]。受加工方式影響，牡蠣腸道常常被人們與肌肉部分同時攝入，由于其腸道中含有大量可導(dǎo)致人體感染胃腸道疾病的微生物，因此，有必要對牡蠣腸道微生物情況進(jìn)行調(diào)查研究。三文魚、北極貝、扇貝、甜蝦、壽司蝦、海膽和蘭花蚌等其他近海生食水產(chǎn)品雖然產(chǎn)量和銷量不及牡蠣，但也面臨著同樣的質(zhì)量安全問題。外海生食水產(chǎn)品則以重金屬富集危害為主，金槍魚(Thunnus)為中國主要食用的外海生食海產(chǎn)品，其年均消費(fèi)量在20萬 t以上[8]并呈逐年增加的趨勢。由于金槍魚等大型魚類位于食物鏈的頂端，體內(nèi)富積的汞等重金屬含量較高，在微生物的作用下也易形成毒性更強(qiáng)的甲基汞[9]。甲基汞是一種具有較強(qiáng)神經(jīng)毒性的污染物質(zhì)[10]，有關(guān)國際組織和世界主要貿(mào)易國家為保護(hù)消費(fèi)者健康，紛紛制定了魚類中重金屬汞的污染限量，中國對肉食性魚類的甲基汞限量為1.0 mg/kg[11]。

為了保證生食水產(chǎn)品質(zhì)量安全，本研究以常見的近海生食產(chǎn)品牡蠣和遠(yuǎn)海生食產(chǎn)品金槍魚為主要研究對象，同時包含市面上常見的其他幾類生食水產(chǎn)品，通過分離樣品中Vp并鑒定其16S rDNA和毒力基因，測定了水產(chǎn)品中主要病原微生物的污染情況。另外，通過宏基因組測序法和HPLC-ICPMS方法，研究牡蠣中的微生物菌群和金槍魚中的重金屬汞含量，以期進(jìn)一步評估影響生食水產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)鍵生物及化學(xué)危害因子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

地點(diǎn)及時間對象：2017年5—10月間對上海市東方國際水產(chǎn)市場、上海市江陽水產(chǎn)市場、浙江省寧波市路林水產(chǎn)市場以及福建省廈門市夏商國際水產(chǎn)市場所售三文魚、金槍魚、牡蠣、北極貝、扇貝、甜蝦、壽司蝦、海膽和蘭花蚌進(jìn)行取樣。樣品編號及各地具體取樣情況見表1。

樣品采樣與處理：受時間等因素影響，本研究采集三文魚樣品24個、北極貝樣品10個、金槍魚樣品7個、牡蠣樣品7個、壽司蝦樣品6個、甜蝦樣品2個、扇貝樣品2個、海膽樣品1個及蘭花蚌樣品1個，共計采樣60份，每份約500.0 g。鑷子、手術(shù)刀及手術(shù)剪經(jīng)高壓滅菌后，將樣品剪碎裝入無菌袋中待下一步處理。

1.1.2 試劑

主要包括：TSB(3% NaCl)培養(yǎng)基與TCBS培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司)；細(xì)菌DNA提取試劑盒、腸道總DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；Taq DNA聚合酶、dNTP(TaKaRa公司)；濃硝酸、乙酸銨(上海安譜)；金標(biāo)準(zhǔn)溶液、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)；氯化甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，Reagecon)；氨水(國藥)；L-半胱氨酸鹽酸鹽(SIGMA)。

表1 試驗(yàn)樣品信息表Tab.1 Sample information

1.1.3 儀器設(shè)備

主要包括：離心機(jī)(5810R，Eppendorf)；PCR儀(6235，Eppendorf)；電泳及凝膠成像分析系統(tǒng)(GelDocXR，Bio-Rad)；酶標(biāo)儀(Synergy 2，BioTek)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9270，上海一恒科技有限公司)；均質(zhì)器(BagMixer，Interscience)；液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(iCAP Q，Thermo Scientific)；微波消解儀(MARS 6，CEM)；超純水儀(Advantage A10，Millipore)。

1.1.4 引物

所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.5 微生物菌群分析

提取DNA后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成分析。

1.2 方法

1.2.1 生食水產(chǎn)品中Vp分離鑒定方法

參考GB 4789.7—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[12]中的方法，對樣品中的Vp進(jìn)行分離并富集培養(yǎng)：取樣品25 g放入無菌均質(zhì)袋，加入225 mL 3%NaCl堿性蛋白胨水均質(zhì)后，于37 ℃培養(yǎng)18 h。后接種到TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行生化鑒定，用甘油管保存陽性菌株存放于-80 ℃冰箱，備用。

1.2.2 Vp毒力基因測定及16S rDNA分型方法

1.2.2.1 細(xì)菌DNA提取

取-80 ℃保存下甘油管中菌種液劃線接種于TCBS平板，挑取單菌落于10 mL TSB(3% NaCl，pH=8.0)試管中，在37 ℃轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)10 h。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取陽性樣品菌株DNA。提取的DNA用酶標(biāo)儀檢測濃度以及純度(A260/A280值)。

1.2.2.2 PCR體系及反應(yīng)條件[13]

在25 μL的PCR反應(yīng)體系下，用PCR進(jìn)行16S rDNA和毒力基因tdh、trh、tlh擴(kuò)增(引物信息見表1)。得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，經(jīng)過blast比對，確認(rèn)其是目的片段。

表2 引物序列信息Tab.2 Primer sequences information

1.2.3 牡蠣中腸道微生物菌群多樣性分析方法

用腸道總細(xì)菌DNA提取試劑盒提取7個牡蠣腸道樣品總DNA，用酶標(biāo)儀檢測濃度，在濃度高于500 ng/μL后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序分析，在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger V4.0分析平臺對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4 金槍魚中總汞及甲基汞含量分析

總汞測定：參考GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》[14]中的方法，樣品經(jīng)微波消解后用ICP-MS內(nèi)標(biāo)法測定總汞含量。

甲基汞測定：參考SN/T 4851—2017《出口水產(chǎn)品中甲基汞和乙基汞的測定液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》[15]中的方法，樣品經(jīng)前處理后用HPLC-ICP-MS外標(biāo)法測定甲基汞含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行作圖，并進(jìn)行方差分析，使用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 生食水產(chǎn)品中Vp分離鑒定結(jié)果

經(jīng)測定，60個樣品中共檢出7個Vp陽性樣品，樣品檢出率為11.7%。9種樣品中共有4種樣品檢出，且檢出率由高至低依次為：牡蠣(28.6%)>金槍魚(14.3%)>三文魚(12.5%)>北極貝(10.0%)(圖1)。對檢出率進(jìn)行顯著性分析表明，牡蠣檢出率顯著高于其他產(chǎn)品(P<0.01)。李海麟等[16]對2009—2014年廣州市生食水產(chǎn)品Vp的監(jiān)測結(jié)果顯示，總體檢出率為11.6%，具體到品種，檢出率由高至低依次為：牡蠣(44.4%)>紅立魚(33.3%)>北極貝(5.88%)>三文魚(5.26%)。其中，總體檢出率與本研究結(jié)果非常接近，且檢出率最高的同樣是牡蠣，說明牡蠣是生食水產(chǎn)品中感染Vp的主要品種；北極貝與三文魚檢出率同樣比較接近，但檢出率均低于本研究。

圖1 生食水產(chǎn)品中副溶血性弧菌鑒定結(jié)果
不同小寫字母檢出率差異顯著(P<0.01)。
Fig.1 Identification ofVibrioparahaemolyticusin raw aquatic products
Different small letters show significant difference detetion rate.

在夏、秋季節(jié)，沿海地區(qū)的消費(fèi)者喜愛生食或半熟的海產(chǎn)品，這些海產(chǎn)品通常以散裝冰鮮方式保存，易造成交叉污染[17]，當(dāng)人們食用了感染副溶血性弧菌的食品后有可能導(dǎo)致腸胃炎等疾病[18]。以2007年上海市腸道疾病調(diào)查為例，由食源性致病菌導(dǎo)致的腸道疾病占總腸道疾病的12.82%，其中，由Vp引發(fā)的疾病占76.92%[19]。本研究表明，牡蠣、三文魚及北極貝均為近海養(yǎng)殖海產(chǎn)品，與近海生食水產(chǎn)品更易遭受生物性污染[1]的特征相符。金槍魚直接感染Vp的報道較少，僅見2007年廣東省出入境檢驗(yàn)檢疫局在一批進(jìn)口鮮黃鰭金槍魚中檢出Vp[20]，本研究的金槍魚中有1個樣品檢出，可能與后期加工過程中交叉污染有關(guān)。這也提示了在食用生食水產(chǎn)品過程中，應(yīng)注意生熟分開、廚具消毒，避免產(chǎn)生交叉污染。

2.2 副溶血性弧菌毒力基因測定及16S分型結(jié)果

分別提取上述7個陽性樣品中的菌株DNA，并將提取得到的DNA用酶標(biāo)儀檢測純度，A260/A280值均在1.8～2.0之間，表明此次實(shí)驗(yàn)提取的DNA純度較高。隨后經(jīng)過PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序，發(fā)現(xiàn)只有5株菌株含有tdh毒力基因(圖2)。而16S分型結(jié)果顯示，同一品種的生食水產(chǎn)品(RA4和RA15)分離得到的Vp反而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而采樣地理位置較近的樣品(RA4和RA8、RA15和RA28、RA17和RA22)分型結(jié)果較為接近，表明樣品中的Vp極有可能是在后期銷售環(huán)節(jié)通過交叉污染獲得的(圖3)。

從圖3可知，RA4和RA8號樣品，RA17和RA22、RA24號樣品，以及RA15和RA28號樣品均是所屬于相鄰的兩個商鋪。值得注意的是，RA8和RA17號樣品來源的兩個商鋪僅一墻之隔。推測相鄰的商鋪間共用冰塊以及人員的互相往來等行為，都有可能是導(dǎo)致Vp在樣品間交叉污染的原因。

圖3 陽性樣品采樣地理位置示意圖
Fig.3 Sampling location diagram of positive samples

注: 表示F區(qū)樣品, 表示K區(qū)樣品, 表示道路。

曹慧慧等[21]在對中國8個沿海城市的水產(chǎn)品調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，62.7%的水產(chǎn)品tlh檢測呈陽性，即這些陽性水產(chǎn)品全都污染了Vp。本研究中，所有生化鑒定陽性菌株tlh檢出率為100%，陽性菌株tdh毒力基因檢出率為71.4%(5/7)，未檢出trh毒力基因。tdh毒力基因占全部樣品的8.3%(5/60)。Vp通過釋放溶血毒素導(dǎo)致人體腹瀉。耐熱直接溶血素(TDH)被認(rèn)為是導(dǎo)致腸胃炎的誘因，而溶血素相關(guān)溶血素(TRH)的氨基酸序列67%與TDH同源，TDH和TRH它們分別由tdh和trh毒力基因編碼，二者都能誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞氯化物分泌[22]。不耐熱溶血素(TLH)的致病機(jī)制尚不明確，但其編碼基因tlh可以同時存在于臨床分離和環(huán)境分離菌株中，因此常用于Vp的分子診斷。所以，不是所有陽性樣品均會致人出現(xiàn)腹瀉等疾病，檢出陽性樣品后應(yīng)該進(jìn)一步測定tlh基因以判斷是否是Vp而不是其他弧菌屬(Vibrionaceae)細(xì)菌，并測定tdh和trh毒力基因以確定致病性。

2.3 牡蠣腸道微生物菌群多樣性分析結(jié)果

通過I-Sanger分析平臺對測序結(jié)果從屬的水平進(jìn)行分析(圖4)。以樣本名為縱坐標(biāo)，菌群物種在該樣本中所占的比例為橫坐標(biāo)，柱顏色的代表不同的菌群物種，柱長度代表該菌群物種所占比例大小。從圖4可知，含量占比前5位的細(xì)菌分別為：擬桿菌(Bacteroides)、芽孢桿菌(Bacilluscohn)、假單胞菌(Pseudomonas)、弧菌(Vibrio)及嗜鹽桿菌(Halobacteriumelazari-volcani)，包含了兩類腐敗菌屬(擬桿菌、假單胞菌)和一類致病菌屬(弧菌)。擬桿菌是水產(chǎn)品加工過程中易感染的腐敗菌，假單胞菌是冷藏水產(chǎn)品中的優(yōu)勢腐敗菌，弧菌是新鮮水產(chǎn)品中的優(yōu)勢腐敗菌以及致病菌[23]。

圖4 牡蠣腸道中微生物菌群多樣性分析
Fig.4 Diversity analysis of microbial flora in oyster intestine

本研究中，擬桿菌、假單胞菌和弧菌3種菌在牡蠣腸道中占比均很高，推斷腸道微生物是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要污染源之一。陳慧斌等[24]研究了4 ℃冷藏期間牡蠣鰓部菌群的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)冷藏后期主要腐敗優(yōu)勢菌群為假單胞菌屬和氣單胞菌屬等。但目前對于水產(chǎn)品中腸道細(xì)菌種群特征的研究甚少。新鮮牡蠣因其自身蛋白質(zhì)含量較高，更有利于微生物的繁殖[25]，進(jìn)而影響牡蠣的K值、TVB-N值、質(zhì)構(gòu)和顏色等，因此微生物菌群可作為反映水產(chǎn)品新鮮度和腐敗程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[26]。同時，一些致病微生物會直接進(jìn)入人體消化道導(dǎo)致一系列腸胃疾病[19]。因此，食用牡蠣前要注意流通運(yùn)輸過程中的冷藏保鮮，避免由腸道微生物過量生長導(dǎo)致腐敗引發(fā)的胃腸道疾病的產(chǎn)生[27]。

2.4 金槍魚中總汞及甲基汞含量分析結(jié)果

長期食用汞含量高的食品易對人體，尤其是胎兒或嬰幼兒造成極大的損害，如甲基汞可干涉大腦組織的發(fā)育，破壞微血管，并影響引導(dǎo)神經(jīng)移動和連接的細(xì)胞粘連分子的時間次序[28]。而魚類吸收甲基汞的效率極高，且清除速度緩慢，導(dǎo)致其體內(nèi)的甲基汞大部分都蓄積在肌肉組織中。金槍魚作為食物鏈頂端的大型食肉魚類，成為了富集甲基汞的載體。為全面了解生食水產(chǎn)品的潛在風(fēng)險，同時對金槍魚的汞等化學(xué)污染因子進(jìn)行了含量測定。結(jié)果如圖5所示，經(jīng)測定，樣品中總汞含量最高達(dá)2.19 mg/kg(RA59)，a表示對總汞含量進(jìn)行顯著性分析，RA59顯著高于其他產(chǎn)品(P<0.01)。Martin等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，魚的營養(yǎng)級越高、魚齡越大，甲基汞在魚肌肉組織中的蓄積含量也越高。也有研究指出,在魚腸和魚肝中可以發(fā)生汞的甲基化反應(yīng),但魚類體內(nèi)自身合成的甲基汞僅占總甲基汞含量的很小一部分,外部輸入仍是主要的甲基汞來源[30]。通常魚體內(nèi)甲基汞含量約占總汞的80%[9]，而且魚類壽命越長，個體越大，體內(nèi)汞含量越高。因此，本研究中有兩個樣品總汞含量高可能是魚齡較長導(dǎo)致的。但從甲基汞含量的結(jié)果可知，甲基汞含量最高為0.916 mg/kg(RA39)，低于國家污染物限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的肉食性魚類甲基汞限量值(1.0 mg/kg)，A表示對甲基汞含量進(jìn)行顯著性分析，RA39和RA59顯著高于其他產(chǎn)品(P<0.05)。由于汞在食物鏈中的逐步富集以及可透過血腦屏障的特性，頻繁大量食用會對孕婦、哺乳期婦女和幼兒造成健康威脅，建議盡快發(fā)布中國居民相關(guān)魚類汞污染的食用風(fēng)險警示。

圖5 金槍魚中總汞及甲基汞含量分析
不同大寫字母表示甲基汞含量差異顯著(P<0.05),不同小寫字母代表汞含量差異顯著(P<0.01)。
Fig.5 Content analysis of total mercury and methyl mercury in tuna
Different capital letters show significant difference in metyl mecury content (P<0.05).Different small letters show significant difference in total mercury content(P<0.01).

3 結(jié)論

本研究評估了幾種常見生食水產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)鍵生物及化學(xué)危害因子情況。生物危害方面：經(jīng)副溶血性弧菌生化鑒定，60個樣品中共檢出7個陽性樣品，檢出率為11.7%；對陽性菌株進(jìn)行毒力基因判定，只有5株菌株含有tdh毒力基因，占全部樣品比例為8.3%；對7個牡蠣腸道中微生物群落分布的研究結(jié)果表明，優(yōu)勢菌群中大多數(shù)為腐敗菌，存在一定生物危害風(fēng)險。汞危害方面：對7個金槍魚樣品中的汞含量分析研究結(jié)果顯示，2個樣品總汞含量超標(biāo)，但經(jīng)測定甲基汞含量均未超標(biāo)。綜上，建議相關(guān)部門加強(qiáng)對生食水產(chǎn)品中生物危害因子的調(diào)研排查及風(fēng)險管控工作。