鄭關(guān)超, 吳海燕, 彭吉星, 郭萌萌, 李兆新, 李揚(yáng), 譚志軍,2*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室：山東 青島 266237；3.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

擬菱形藻屬(Pseudo-nitzschia)是一類常見的海洋浮游羽狀硅藻，廣泛分布于全球近岸海域，是藻神經(jīng)毒素多莫酸(domoic acid，DA)的重要生物來源[1]。目前已發(fā)現(xiàn)52種擬菱形藻，其中26種能夠產(chǎn)生DA，且新的物種還在不斷被發(fā)現(xiàn)[2-3]。中國學(xué)者曾對(duì)中國沿海廣泛分布的擬菱形藻進(jìn)行研究，均未檢測(cè)到DA。直到2017年在廣東省沿海地區(qū)成功分離鑒定出1個(gè)產(chǎn)毒新種——偽裝擬菱形藻，這是關(guān)于中國產(chǎn)毒擬菱形藻的第一次報(bào)道[4]。近年來，在中國沿海陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了福氏擬菱形藻(Pseudo-nitzschiafukuyoi)[5]、多列擬菱形藻(Pseudo-nitzschiamultiseries)[2]等其他產(chǎn)毒擬菱形藻，但發(fā)現(xiàn)的種類仍十分有限，需要更多的相關(guān)研究。

DA可以引起人類嘔吐、腹瀉、腹部痙攣、頭痛和頭暈等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致呼吸困難、癲癇發(fā)作、永久性喪失短期記憶，甚至昏迷或死亡。由于患者中毒以失憶缺失為主要癥狀，因此將其命名為記憶缺失性毒素。1987年加拿大愛德華地區(qū)發(fā)生了DA中毒事件，造成至少4人死亡，主要原因是食用了受污染的紫貽貝(Mytilusedulis)，其DA含量高達(dá)900 μg/g，這是首次被記錄的有關(guān)DA的中毒事件[6]。隨著其在全球引發(fā)的中毒事件不斷增多，DA備受關(guān)注[7-8]。近年來，在中國部分海洋生物中，如牡蠣(Crassostreagigas)、扇貝(Chlamysfarreri)等也不斷發(fā)現(xiàn)存在DA污染的情況。目前，蟹類中檢測(cè)到的DA含量最高，為18.20 μg/g，其他水產(chǎn)品如陸蛤(8.14 μg/g)、蛤蜊(4.16、0.02及0.94 μg/g)、珍珠母(4.04 μg/g)、扇貝(5.20、10.11 μg/g)和貽貝(1.68 μg/g)等也均有檢出[9-13]。雖然水產(chǎn)品中DA含量均低于目前國際認(rèn)可的20 μg/g安全預(yù)警值[8]，但已有研究報(bào)道小鼠長(zhǎng)期暴露于低劑量DA環(huán)境中可導(dǎo)致行為改變及認(rèn)識(shí)缺陷[14]，孕前暴露可導(dǎo)致小鼠永久性神經(jīng)毒性[15]。擬菱形藻屬在中國沿海分布廣泛，貝類極易通過自身濾食蓄積DA，并經(jīng)食物鏈放大作用，對(duì)人類健康造成威脅，給生態(tài)和食品安全帶來嚴(yán)峻的考驗(yàn)，亟需進(jìn)行安全管控。因此，有針對(duì)性地科學(xué)評(píng)價(jià)貝類中DA的風(fēng)險(xiǎn)來源及控制關(guān)鍵點(diǎn)，具有重要的意義。

本研究通過將3種不同貝類品種暴露在一株產(chǎn)DA多列擬菱形藻(MC4181)中，初步研究了DA在不同貝類中的蓄積含量差異，分析了各組織中DA的分布情況及主要的蓄積靶器官，探討了貝類體質(zhì)量與DA蓄積含量的相關(guān)性，以期為開展中國貝類毒素調(diào)查研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為系統(tǒng)開展貝類毒素風(fēng)險(xiǎn)防控技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藻株

實(shí)驗(yàn)所用單克隆藻株由華南師范大學(xué)提供，為產(chǎn)DA多列擬菱形藻(Pseudo-nitzschiamultiseries，MC4181)，于2017年5月分離自臺(tái)灣海峽。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用1 L錐形瓶，加入500～700 mL的L1培養(yǎng)基，放在光照強(qiáng)度約50～80 μmol photons/(m2·s)，光周期12 h∶12 h和溫度(20±2)℃的條件下培養(yǎng)。每隔2～3 d取3 mL藻液，以魯格氏液固定后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡鏡檢，以確保藻細(xì)胞生長(zhǎng)良好。L1培養(yǎng)基的鹽度為30，pH為8.0。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

主要包括：L1培養(yǎng)基所用試劑均為優(yōu)級(jí)純(國藥集團(tuán));乙腈(HPLC級(jí)，ThermoFisher Scientific);甲醇(HPLC級(jí)，Merk公司);甲酸(HPLC級(jí)，上海安譜);甲酸銨(HPLC級(jí)，Sigma公司);DA標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大海洋生物研究所，CAS號(hào)14277-97-5，CRM-DA-f);強(qiáng)陰離子固相萃取柱(Agilent公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

主要包括：TSQ Endura液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；智能光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；旋渦混合器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(Neofuge 1600，上海力申科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(Millipore公司)；固相萃取裝置(Supelco公司)；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-ⅡN，寧波新芝生物科技股份有限公司)；超低溫保存箱(-80℃，Haier)；電子分析天平(德國賽多利斯公司)；超聲清洗機(jī)(德國艾爾瑪公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)毒擬菱形藻的培養(yǎng)

使用0.45 μm孔徑的混合纖維素酯膜過濾新鮮海水，于121 ℃下高溫高壓滅菌20 min。冷卻至室溫后，配制L1培養(yǎng)基。在5 L錐形瓶中接入產(chǎn)毒多列擬菱形藻，藻細(xì)胞初始接種濃度為10 000 cells/mL，按照上述培養(yǎng)條件進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。接種后從第1天開始每隔1天(第1、3、5、7、9、11、13和15天)進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，以確定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間及藻細(xì)胞濃度。

1.2.2 不同貝類的暴露實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、紫貽貝及太平洋牡蠣(Crassostreagigas)均產(chǎn)自青島市膠南良種養(yǎng)殖場(chǎng)的二齡貝，經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定未受DA污染，櫛孔扇貝、紫貽貝及太平洋牡蠣的平均軟體部質(zhì)量分別為(16.17±3.35) g、(2.84±0.83) g 及(15.26±6.52) g。實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，暫養(yǎng)期間不投喂餌料藻，水溫(15±1)℃，24 h不間斷充氣。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，貝類暴露實(shí)驗(yàn)共持續(xù)4 d，試驗(yàn)期間不進(jìn)行取樣，最后一天收取所有貝類樣品。隨機(jī)選取大小不一的櫛孔扇貝、紫貽貝及太平洋牡蠣各60只，于3個(gè)盛有20 L海水的水槽中進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。日換水量100%，并徹底清洗水槽中的殘留物質(zhì)。投喂螺旋藻粉，日投喂量為每只貝10 mg/d，投喂對(duì)數(shù)期產(chǎn)毒藻，日投喂量為10 000 cells/mL，暴露期間3種貝類24 h濾食藻細(xì)胞在90%以上，暴露結(jié)束后選取櫛孔扇貝、紫貽貝及太平洋牡蠣各35只，測(cè)量其形態(tài)指數(shù)(整濕質(zhì)量、軟體部質(zhì)量、殼高、殼寬和殼長(zhǎng))并取整個(gè)軟體部。分別取15只櫛孔扇貝、紫貽貝及太平洋牡蠣的軟體部，分離鰓絲、內(nèi)臟團(tuán)、性腺、閉殼肌和外套膜共5個(gè)組織部位，保存于-80 ℃冰箱待分析。

1.2.3 毒素分析

軟體部及各組織部位DA毒素含量測(cè)定參考GB5009.198—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中失憶性貝類毒素的測(cè)定》中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)前處理方法，并改進(jìn)液相及質(zhì)譜條件。

液相色譜條件：樣品分析在TSQ Endura液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行。色譜柱為(Phenomenex C18，100.0 mm×2.1 mm×2.6 μm)，柱溫35 ℃，樣品室溫度15 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。流動(dòng)相A為水(含2 mmol/L甲酸銨，加100 μL甲酸), 流動(dòng)相B為100%甲醇。梯度洗脫條件: 0～1.0 min, 20% B; 1.1～3.0 min，20%～90% B; 3.1～8.0 min, 20%B。流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM), 噴霧電壓3 500 V，鞘氣壓力為25 Arb，輔助氣壓力15 Arb，離子傳輸管溫度為300 ℃，蒸發(fā)氣溫度為250 ℃，定量定性離子對(duì)m/z分別為 312.1/266.1、312.1/248.1，駐留時(shí)間為100 ms。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用游標(biāo)卡尺(精確至0.01 mm)測(cè)量3種貝類形態(tài)指數(shù)，不同貝類蓄積毒素含量差異比較采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異性分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman非參數(shù)檢驗(yàn)，Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖，各分析顯著性水平設(shè)置為P<0.05，極顯著水平設(shè)置為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種貝類各性狀的表型統(tǒng)計(jì)量

貝類表型性狀作為貝類在遺傳育種及選育中重要的參考依據(jù)，對(duì)于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義，形態(tài)性狀(殼長(zhǎng)、殼高及殼寬等)和經(jīng)濟(jì)性狀(整濕重、軟體重等)一般具有顯著的相關(guān)性[16-17]。本研究選取殼長(zhǎng)、殼高、殼寬、整濕質(zhì)量及軟體部質(zhì)量作為不同貝類的統(tǒng)計(jì)性狀，測(cè)量所得的3種貝類的各性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)見表1。可以看出太平洋牡蠣殼長(zhǎng)、殼寬及整濕質(zhì)量最大，分別為(99.01±18.05) mm、(27.14±7.30)mm和(61.15±22.33) g，而櫛孔扇貝殼高、軟體部質(zhì)量最大，分別為(64.66±4.84) mm、(16.17±3.35) g。從變異系數(shù)來看，太平洋牡蠣各性狀的變異系數(shù)較大，說明太平洋牡蠣各性狀參數(shù)離散程度較高。

2.2 3種貝類中DA毒素蓄積含量比較

采用LC-MS/MS法對(duì)3種貝類(各35只)的軟體部中DA含量進(jìn)行定性定量分析(圖1)。已有調(diào)查研究顯示，不同貝類對(duì)DA的蓄積具有顯著差異性，如吉薇等[9]在南海海域調(diào)查發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝中DA的蓄積含量為10.11 μg/g，而翡翠貽貝中僅為0.69 μg/g；王恒等[12]對(duì)舟山海域調(diào)查結(jié)果則顯示扇貝、牡蠣、毛蚶及青蛤等不同貝類中含量范圍為ND～1.68 μg/g,含量差異明顯。本研究采用單細(xì)胞產(chǎn)毒水平為30.46 fg/cell 產(chǎn)DA有毒藻[18]，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)3種不同的貝類暴露4 d后發(fā)現(xiàn)，太平洋牡蠣蓄積平均含量為7.99 μg/kg，最大蓄積量為42.40 μg/kg，蓄積能力最強(qiáng)；而其他兩種貝類蓄積含量相對(duì)較低，如紫貽貝中DA蓄積平均含量為2.51 μg/kg，最大蓄積量為15.49 μg/kg，櫛孔扇貝中DA蓄積含量最小，平均含量?jī)H為2.23 μg/kg。

表1 各性狀的表型統(tǒng)計(jì)量Tab.1 Phenotypical statistics of various traits n=35

不同貝類中DA蓄積含量差異較大，具有顯著差異性。太平洋牡蠣的蓄積能力均顯著高于櫛孔扇貝和紫貽貝(P<0.01)，而櫛孔扇貝與紫貽貝蓄積能力則相近(P>0.05)。3種貝類中太平洋牡蠣的DA蓄積含量最高，約為櫛孔扇貝和紫貽貝的3倍，與中國舟山等海域調(diào)查結(jié)果相近[10,12]，太平洋牡蠣對(duì)DA的蓄積能力相對(duì)于紫貽貝等要強(qiáng)，這可能與牡蠣消除DA的速率低于貽貝有關(guān)[19]。

圖1 3種貝類中毒素蓄積含量比較
不同字母代表差異顯著。
Fig.1 Comparison of toxin accumulation in three kinds of shellfishes
Different letters show significant difference.

2.3 3種貝類不同組織中DA毒素蓄積含量比較

采用LC-MS/MS法對(duì)3種貝類(各15只)各組織中DA含量進(jìn)行定性定量分析(圖2)，結(jié)果顯示，3種貝類中內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、鰓絲、性腺及閉殼肌等均具有一定DA蓄積能力，但均是內(nèi)臟團(tuán)的蓄積能力最高。DA的高親和位點(diǎn)可能位于不同貝類組織，導(dǎo)致不同貝類中各組織蓄積DA的含量差異明顯[19]。此外，DA攝入后不同貝類通過腸道膜轉(zhuǎn)運(yùn)DA的能力也不相同，而內(nèi)臟中很大比例的DA是通過血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至其他組織[20]。本研究中，櫛孔扇貝、紫貽貝及太平洋牡蠣內(nèi)臟團(tuán)DA蓄積含量分別為11.12、1.63和26.96 μg/kg，而其他組織中DA蓄積含量相對(duì)較低，但含量差異明顯。3種貝類性腺中DA含量也較高，分別為1.45、0.37及12.31 μg/kg。鰓絲作為貝類重要的呼吸器官，其DA蓄積含量在櫛孔扇貝中僅次于內(nèi)臟團(tuán)，為3.68 μg/kg；在太平洋牡蠣中含量也僅次于內(nèi)臟團(tuán)和性腺中的DA含量，為11.43 μg/kg。

水溶性貝類毒素(如DA)和麻痹性貝類毒素，代謝消除機(jī)制一般包括排泄物排出、組織交換、毒素降解或者代謝轉(zhuǎn)化為無毒或毒性較小的化合物等途徑[21]。本研究發(fā)現(xiàn)3種貝類蓄積DA的主要靶器官均為內(nèi)臟團(tuán)，且太平洋牡蠣中蓄積含量最高，櫛孔扇貝次之，紫貽貝含量最小，這與內(nèi)臟團(tuán)作為主要代謝器官的事實(shí)吻合。Bogan等[22]的研究顯示扇貝內(nèi)臟組織中的DA蓄積含量占整個(gè)軟體部的90%以上，Grimmelt等[23]的研究也表明紫貽貝內(nèi)臟中大約占93%，與本研究結(jié)果相一致，均說明內(nèi)臟團(tuán)為貝類蓄積DA的主要器官。

櫛孔扇貝中各組織蓄積DA含量的大小順序?yàn)椋簝?nèi)臟團(tuán)>鰓絲>性腺>外套膜>閉殼??；太平洋牡蠣中為：內(nèi)臟團(tuán)>性腺>鰓絲>外套膜>閉殼??；而貽貝中則為：內(nèi)臟團(tuán)>閉殼肌>性腺>外套膜≈鰓絲(圖2)。其他貝類毒素，如麻痹性貝類毒素、氮雜螺環(huán)酸毒素等，也發(fā)現(xiàn)類似的研究結(jié)果[24-25]。本研究數(shù)據(jù)顯示，3種貝類的5個(gè)組織中，內(nèi)臟團(tuán)和性腺的含量要相對(duì)較高，為更好地保障消費(fèi)者身體健康，建議食用牡蠣等貝類時(shí)盡量剔除內(nèi)臟團(tuán)，以降低中毒的風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 3種貝類不同組織中毒素蓄積含量比較(n=15)
Fig.2 Comparison of toxin accumulation in different tissues of three kinds of shellfishes(n=15)

2.4 3種貝類形態(tài)性狀與DA蓄積含量的相關(guān)性

對(duì)3種不同貝類的性狀參數(shù)與軟體部中DA蓄積含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，櫛孔扇貝與太平洋牡蠣各性狀參數(shù)與軟體部中DA蓄積含量均沒有顯著相關(guān)性(P>0.05)，但在紫貽貝中發(fā)現(xiàn)其軟體部中DA蓄積含量與殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、整濕質(zhì)量和軟體部質(zhì)量等性狀參數(shù)均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，軟體部質(zhì)量與DA蓄積含量相關(guān)性最大且呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(表2)。這說明個(gè)體較小的紫貽貝蓄積DA的能力要高于較大的個(gè)體，這對(duì)水產(chǎn)品中毒素調(diào)查以及食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的參考意義。類似的研究結(jié)果在牡蠣[19]、扇貝[22]中均有報(bào)道，這可能是因?yàn)樾€(gè)體貝類清除速率較低而更容易蓄積DA。本研究只在紫貽貝中發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，在其他2種貝類中未發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，可能與本次研究暴露貝類的數(shù)量較少以及時(shí)間較短有關(guān)。此外，也有相關(guān)研究顯示DA蓄積含量與貽貝等個(gè)體大小不具有顯著相關(guān)性[26]，因此，DA蓄積含量與貝類個(gè)體大小等性狀參數(shù)的相關(guān)性還需要更多的相關(guān)研究進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果對(duì)于準(zhǔn)確闡明貝類中DA的真實(shí)風(fēng)險(xiǎn)，確保貝類產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有積極的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。

表2 紫貽貝各性狀間的相關(guān)系數(shù)Tab.2 The correlation coefficients between various traits in Mytilus edulis

注：“**”代表P<0.01。

3 結(jié)論

擬菱形藻屬屬于沿海赤潮中細(xì)胞濃度較高的藻類[27]，是廣泛分布于中國近岸水體的浮游硅藻類群。人類以及許多海洋動(dòng)物，如海獅、海鳥、海獺和鯨等可通過食用浮游生物、魚類、軟體動(dòng)物和磷蝦等途徑在體內(nèi)蓄積DA。本研究發(fā)現(xiàn)，3種貝類中，太平洋牡蠣對(duì)DA的蓄積能力最強(qiáng)，3種貝類的主要蓄積靶器官均為內(nèi)臟團(tuán)，紫貽貝軟體部質(zhì)量大小與DA蓄積含量具有顯著相關(guān)性。研究結(jié)果可為貝類中該毒素的污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及消費(fèi)者食品安全保護(hù)提供理論基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。