陳永平，韓現(xiàn)芹，付志茹，陳建，李春青，李寶華

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(天津)，天津 300221)

孔雀石綠類和酰胺醇類藥物因具有抗菌譜廣、價格低廉及藥效穩(wěn)定等特點(diǎn)，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖和鮮活水產(chǎn)品運(yùn)輸過程中被廣泛應(yīng)用[1-2]，用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病。但該類藥物可以在水產(chǎn)品組織中富集，對消費(fèi)者健康造成危害。研究表明，孔雀石綠(malachite green，MG)被動物體吸收后會迅速代謝為隱色孔雀石綠(leucomalachitegreen，LMG)，其在魚體內(nèi)代謝消除速率緩慢，殘留時間較長，且LMG可對人類產(chǎn)生致畸、致癌及致突變等副作用[3]。氯霉素(chloramp-henicol，CAP)屬酰胺醇類藥物，可引起人體再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，還會使致病菌產(chǎn)生耐藥性[4-5]。目前許多國家已將CAP和MG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，中國也明確規(guī)定禁用CAP和MG，在動物性食品中不得檢出。甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)和氟甲砜霉素(florfenicol，F(xiàn)F)因具有抗菌譜廣、吸收迅速且無交叉耐藥性等特點(diǎn)，已成為了CAP的主要替代藥物[6]，各國分別制定了二者在可食性動物組織中的最高殘留限量[7-8]。

目前，水產(chǎn)品中孔雀石綠類和酰胺醇類檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[9-13]、氣相色譜法(GC)[14-15]、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[16-17]和液質(zhì)聯(lián)用法等[18-27]。謝世紅等[1]通過液相質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中MG和CAP殘留，該方法經(jīng)乙腈提取直接過氧化鋁柱，雜質(zhì)去除效果有限，易產(chǎn)生干擾。李麗春等[28]通過QuECHRS結(jié)合UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留及基質(zhì)效應(yīng)，該方法以酰胺醇類為研究對象，以酸化乙腈作為提取劑，上清液直接過微濾膜上機(jī)，但沒有涉及其他漁藥殘留的測定，檢測效率尚有提升空間。本研究通過優(yōu)化儀器參數(shù)和前處理?xiàng)l件，建立了同步快速測定水產(chǎn)品肌肉組織中孔雀石綠類和酰胺醇類抗生素殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，該方法檢測時間短、檢測成本低且效率高，具有操作簡單、快速及靈敏等特點(diǎn)，適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠類和酰胺醇類抗生素殘留量的測定。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

主要包括：孔雀石綠(MG)、隱色孔雀石綠(LMG)、氘代孔雀石綠(MG-D5)、氘代隱色孔雀石綠(LMG-D6)、氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟甲砜霉素(FF)和氘代氯霉素(CAP-D5)(純度≥98%,德國Dr.Ehrensorfer公司)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸(色譜純，美國Fisher公司)；N-丙基乙二胺(PSA)(分析純，美國CNW公司)；氯化鈉和無水硫酸鎂(分析純，天津龍騰化工有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2儀器和設(shè)備

主要包括：AB 5500 Qtrap三重四極桿質(zhì)譜(AB Sciex公司)；電子天平(Sartoriusgz公司)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；高速組織勻漿機(jī)(IKA T25飛利浦公司)；MS1 Mini-shaker 渦輪振蕩器(IKA公司)；MiLLi-Q純水器(Millipore公司)；氮吹儀(Organomation Associates公司)；超聲波震蕩儀(BUCHI公司)；移液器 (Eppendorf公司)。

1.3 方法與步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取MG、LMG、孔雀石綠內(nèi)標(biāo)(MG-D5)、隱色孔雀石綠內(nèi)標(biāo)(LMG-D6)、CAP、TAP、FF及氯霉素內(nèi)標(biāo)化合物(CAP-D5)各10 mg，分別用乙腈定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL的單內(nèi)(外)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18 ℃下避光保存。吸取各外標(biāo)儲備液1.0 mL，乙腈定容至100 mL，配制成1.0 μg/mL混合外標(biāo)中間液。吸取各內(nèi)標(biāo)儲備液1.0 mL，乙腈定容至100 mL，配制成1.0 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)中間液。取上述中間液，用乙腈稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

分別準(zhǔn)確稱取草魚(Ctenopharyngodonidellus，購于天津水產(chǎn)品批發(fā)市場)和南美白對蝦(Penaeusvannamei，購于天津水產(chǎn)品批發(fā)市場)肉糜樣品5.00 g于50 mL塑料離心管中，加入100.0 ng/mL MG-D5、LMG-D6和CAP-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液30 μL于1.3.1中已配好的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后加入10 mL乙腈、3 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉，同時加入150 mg PSA。渦旋提取1 min，超聲波振蕩10 min，8 000 r/min離心3 min，移取上清液至15 mL玻璃離心管中，50 ℃下氮吹至近干，1 mL乙腈水(1∶1，V/V)定容，過0.22 μm微濾膜，待UPLC-MS/MS測定。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱為島津Shim-pack XR-ODS (75.0 mm × 2.1 mm i.d., 2.0 μm particle size)；流動相A為甲醇，流動相B為超純水；流速0.35 mL/min; 柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積3.0 μL。采用梯度洗脫分離孔雀石綠和酰胺醇類化合物，洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 The gradient elution process of each mobile phase

注：φ(A)示流動相A體積分?jǐn)?shù)，φ(B)示流動相B體積分?jǐn)?shù)。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧離子源(ESI)正負(fù)離子切換模式；離子源溫度500 ℃；氣簾氣20 psi；碰撞氣(CAD)Medium；噴霧電壓±5 000 V；輔氣1為60 psi；輔氣2為40 psi；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 目標(biāo)化合物質(zhì)譜條件Tab.2 Mass spectrometric conditions for monitoring the target compounds

續(xù)表2,Tab.2 Continued

注：“*”代表定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

為同時使孔雀石綠類和酰胺醇類藥物達(dá)到滿意的分離效果，選取了甲醇-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水 4 種不同的流動相體系進(jìn)行對比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲醇-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液作為流動相可提高M(jìn)G的離子化程度，但低濃度的甲酸水對負(fù)離子模式下酰胺醇類藥物的信號響應(yīng)有抑制作用，對TAP素信號抑制作用尤為明顯；甲醇-水、乙腈-水作為流動相，以甲醇-0.05%甲酸水或甲醇-水為流動相均可以實(shí)現(xiàn)分離(圖1)，乙腈-水作為流動相時LMP信號響應(yīng)值較甲醇-水作為流動相時低(圖2)，采用甲醇-水作為流動相，并未出現(xiàn)明顯的峰拖尾現(xiàn)象(圖1)，因此，選擇甲醇-水作為流動相。

圖1 甲醇-水作為流動相總離子流圖
Fig.1 Total ion chromatogram for methanol-water as mobile phase

圖2 乙腈-水作為流動相總離子流圖
Fig.2 Total ion chromatogram for acetonitrile-water as mobile phase

2.1.2 色譜柱的選擇

分別選擇Thermo C18柱(100.0 mm×2.1 mm i.d.，5.0 μm particle size)，Shim-pack XR-ODS C8柱(75.0 mm×2.1 mm i.d.，2.0 μm particle size)以及Phenom-enex XB-C18柱(150.0 mm×2.6 mm i.d.，2.6 μm particle size)，以甲醇-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Thermo C18柱，化合物峰型較寬，不適用于痕量檢測；Phenom-enex XB-C18柱，分離效果欠佳，有色孔雀石綠不出峰；Shim-pack XR-ODS C8柱峰型和分離效果均優(yōu)于Thermo C18柱和Phenomenex XB-C18柱，因此，最終實(shí)驗(yàn)選擇Shim-pack XR-ODS C8柱(75.0 mm×2.1 mm i.d.，2.0 μm particle size)作為孔雀石綠類和酰胺醇類藥物分離色譜柱。

2.2 質(zhì)譜掃描方式的選擇優(yōu)化

為獲得孔雀石綠類和酰胺醇類化合物理想的信號強(qiáng)度，選擇3種掃描方式：(1)分段掃描方式，0～3.5 min負(fù)離子掃描，3.5～6.0 min正離子掃描方式；(2)0～6.0 min正負(fù)離子切換掃描；(3)Schedule掃描方式，在化合物保留時間±30 s設(shè)定掃描。采用掃描方式(1)，LMG和酰胺醇類藥物信號強(qiáng)度較高，有色孔雀石綠信號強(qiáng)度較弱(圖3)；采用掃描方式(2)，峰型和響應(yīng)強(qiáng)度均較好(圖4)；采用掃描方式(3)，峰型欠佳，易受保留時間不穩(wěn)定的限制。實(shí)驗(yàn)最終選擇正負(fù)離子切換掃描方式掃描(圖5)。

圖3 Thermo C18柱分離效果圖
Fig.3 Chromatogram for separation effect on Thermo C18

圖4 分段掃描模式色譜圖
Fig.4 Chromatogram for different-period scanning mode

圖5 Schedule模式掃描色譜圖
Fig.5 Chromatogram for schedule scanning mode

2.3 提取溶劑的選擇

根據(jù)孔雀石綠類和酰胺醇類化合物的極性特點(diǎn)，分別選擇常用的有機(jī)提取溶劑乙腈、酸化乙腈(0.1%鹽酸)、乙酸乙酯和二氯甲烷進(jìn)行提取效果的比較。選取空白草魚肌肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測定，各組分添加量均為10.0 μg/kg，通過比較回收率評價各種提取劑的提取效果。如圖6所示，乙酸乙酯對酰胺醇類化合物的提取效果最好，提取效率最高，但對MG和LMG的提取效果差，提取效率低；二氯甲烷對MG和LMG取效果最好，但由于水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，大部分基質(zhì)含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，提取后仍需固相萃取柱凈化后才能上機(jī)，步驟多而耗時；乙腈和酸化乙腈提取效果均較好，乙腈的極性較大，具有沉淀蛋白作用，配合使用QuEChERS方法，去除脂肪和蛋白質(zhì)效果較好。而酸化乙腈提取吹干定容后上機(jī)，殘留的酸會對酰胺醇類化合物產(chǎn)生信號抑制，重復(fù)性不理想。綜上，最終實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為該方法的提取試劑。

圖6 不同提取試劑對孔雀石綠和酰胺醇類化合物提取回收率的影響(n=6)
Fig.6 The effects of different extracting solution for the recovery of malachite green and amphenicols (n=6)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

用乙腈將MG、LMG、TAP、CAP和FF標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成梯度混合標(biāo)準(zhǔn)液，MG、LMG、CAP和FF質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 ng/mL，TAP質(zhì)量濃度為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL。在上述液相色譜和質(zhì)譜條件下，以MG-D5、LMG-D6和CAP-D5為內(nèi)標(biāo)，用儀器自帶工作站按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行自動計算，以峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)Y、化合物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品的峰面積響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，算得樣品制備液的實(shí)際測定濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MG、LMG、CAP和 FF在質(zhì)量濃度0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r在0. 999 4～0.999 9之間；TAP在質(zhì)量濃度2.0～100.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 6)，結(jié)果見表3。MG、LMG、CAP、TAP和FF的檢出限(LOD)分別為 0.1、0.1、0.1、0.4和0.1 μg/kg；定量限(LOQ)分別為0.5、0.5、0.5、2.0和0.5 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖7。

表3 孔雀石綠和酰胺醇類的回歸方程以及相關(guān)系數(shù)Tab.3 Regression equations and correlation coefficients of malachite green and amphenicols

圖7 化合物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖
Fig.7 Chromatogram for the analytical standard

2.5 方法回收率和精密度

選取空白草魚和南美白對蝦樣品，分別添加3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平制備6個平行樣品計算添加回收率，在添加濃度范圍內(nèi)，孔雀石綠類和酰胺醇類抗生素的回收率在72.0%～102.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.9%～6.4%(表4)，為驗(yàn)證方法的可行性，試驗(yàn)還選擇鯽(Carassiusauratus)、鳙(Aristichthysnobilis)、半滑舌鰨(CynoglossussemilaevisGunther)和蟹等作為空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收效果試驗(yàn)，回收率均在70.0%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 15%，因此判斷本方法適合水產(chǎn)品基質(zhì)中上述藥物殘留測定。

表4 樣品中化合物的加標(biāo)回收率及精密度Tab.4 Spiked recoveries and precisions of the analytes in samples n=6

2.6 實(shí)際樣品的測定

使用本研究建立的方法用于國內(nèi)市場的90個水產(chǎn)樣品：草魚、鯽、鳙、半滑舌鰨、南美白對蝦及烏鱧(OphiocephalusargusCantor)進(jìn)行分析檢測，其中，2個草魚樣品中檢出FF含量為8.90 μg/kg和4.75 μg/kg，其他均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-UPLC-MS /MS法同時測定水產(chǎn)品中 2種孔雀石綠類和 3種酰胺醇類抗生素殘留的分析方法，MG、LMG、CAP和FF在0.5～50.0 ng/mL質(zhì)量濃度內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r大于0.999 4。MG、LMG、CAP和FF檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，TAP素檢出限為0.4 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。本方法靈敏、準(zhǔn)確且簡單，能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范的技術(shù)要求。