王 楠 郭 霞 武俊平 賈 璐 雍 雯 劉 穎 肖慶博 劉美玉 吳麗娥

包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內二科，內蒙古 包頭 014010

腦微出血(cerebral microbleeds，CMBs)是指腦小血管壁損害，血液從血管壁滲出形成含鐵血黃素，在腦實質沉積為主要特征的亞臨床性腦實質損害[1]。由于其出血量少，臨床上無明顯癥狀和體征，因此，目前診斷主要依靠影像學。隨著科學技術的進步，目前研究發(fā)現(xiàn)，腦微出血的發(fā)生是導致腦出血、缺血性腦卒中、死亡和癡呆發(fā)病的高危因素[2]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一種視網膜色素上皮細胞分泌的蛋白，具有多種生物學功能，且其啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點(SNP)可能通過影響基因轉錄活性而改變蛋白的表達。研究顯示，PEDF可能與黃斑變性、糖尿病微血管病變、慢性腎病微血管病變等存在相關性[3]。目前關于PEDF及其基因多態(tài)性與腦微出血的相關性研究尚無報道，本研究探討血清PEDF及其基因啟動子區(qū)rs12948385的多態(tài)性與腦微出血的關系，旨在為腦微出血的防治提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 研究對象 納入2017-12—2019-09包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內二科收治的CMBs患者55例為病例組，同期55例健康體檢者為對照組。CMBs診斷標準：根據(jù)2015年《中國腦小血管病診治專家共識》[4]，磁共振SWI序列上圓形或卵圓形、質地均一，直徑2～5 mm且周圍無水腫的低信號病灶，并除外顱內鈣化。納入標準：(1)年齡>18歲；(2)完成常規(guī)MR和SWI檢查確診為CMBs的入院患者。排除標準：(1)經頭部MRI或CT證實有動靜脈畸形、海綿狀血管瘤、毛細血管擴張癥、急性腦梗死及腦腫瘤患者；(2)影像學疑似多發(fā)性硬化、視神經脊髓炎、進行性多灶性白質腦病等白質變性疾??；(3)有明確腦外傷史；(4)合并嚴重心、肺、肝、腎衰竭，嚴重感染、自身免疫性疾??；(5)有心臟起搏器、惡性腫瘤者，有血液系統(tǒng)、糖尿病微血管疾病者。

1．2 方法 患者入院后，完成SWI檢查(圖1)。登記患者一般資料和既往史，第2天空腹抽血，完成血常規(guī)、生化、凝血、血糖、尿酸等相關檢查。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清PEDF濃度(江蘇酶免公司)。使用基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取全血DNA，采用聚合酶鏈式反應-限制性核酸內切酶片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)進行PEDF-rs12948385基因分型用Prime5.0設計引物，由博邁德生物技術有限公司合成。上游引物為5’-CTACAGGTGCGCGCCAAC-3’，下游引物為5’-CTAAGGCGCACACATTTGCACA-3’。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產物用限制性內切酶HincⅡ 37 ℃水浴20 min消化。根據(jù)酶切后出現(xiàn)片段的大小得出rs12948385的基因分型結果：GG：351 bp；AA：280 bp、71 bp；GA：351 bp、280 bp、71bp。

2 結果

2．1 2組一般資料及PEDF濃度比較 CMBs組與健康對照組血小板計數(shù)和低密度膽固醇比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，2組年齡、空腹血糖、同型半胱氨酸、血清PEDF濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較Table 1 Comparison of general information of two groups

注：PLT：血小板；LDL-C：低密度脂蛋白；Hcy：同型半胱氨酸；PEDF：色素上皮衍生因子

圖1 頭顱SWI示雙側大腦皮質多個直徑2～5 mm的微出血灶(如箭頭所示)Figure 1 SWI of the skull shows multiple microbleeds with diameters of 2 to 5 mm on both sides of the cerebral cortex (showing by the arrows)

2．2 Logistic 回歸分析 將CMBs作為因變量，以年齡、空腹血糖、Hcy、血PEDF作為自變量，做多因素非條件Logistic回歸分析，結果顯示，血PEDF、年齡與CMBs明顯相關(血PEDF，OR=0.980，95%CI0.962～0.998，P<0.05；年齡OR=1.070，95%CI1.000～1.144，P<0.05)。

2．3 基因型分析 PEDF-rs12948385位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。2組PEDF-rs12948385的基因型(GG、GA、AA)和等位基因(G/A)的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。由于AA基因型出現(xiàn)頻率小，將AA與GA基因型合并，校正年齡、性別、空腹血糖后與GG基因型相比，AA+GA基因型增加腦微出血的發(fā)病風險是GG組的6.443倍(OR=6.443，95%CI=1.082～38.351)。

表2 2組基因型與等位基因的分布頻率比較 [n(%)]Table 2 Comparison of the distribution frequencies of genotypesand alleles of the two groups [n(%)]

3 討論

PEDF是一種多功能蛋白，與多種微血管疾病的發(fā)生密切相關，但其相關研究大多局限于視網膜病變、糖尿病微血管病變和腫瘤等疾病。在2005年的一項動物實驗中發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病大鼠腎臟的腎小球和腎小管上皮細胞、間質組織中PEDF及mRNA的表達均顯著降低[5]，但2014年一篇報道通過對2型糖尿病患者平均4 a的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病腎病患者血清PEDF水平可代償性升高[6]。但對于PEDF的作用機制還不甚明確，相關學者認為PEDF通過減少新生血管生成，保護血管內皮細胞完整性減少蛋白尿漏出[7]。CMBs是一種常見的腦小血管病，與糖尿病腎病同屬于微小血管疾病，同時，腦和腎臟的小血管系統(tǒng)在整個心動周期中均暴露在高血流、高壓力的血流沖擊下，屬于應變血管，具有相似的血管調控機制和解剖結構[8]，因此推測PEDF與CMBs的發(fā)生同樣密切相關。

本研究顯示，CMBs組PEDF血清濃度低于健康對照組，且進一步多因素非條件Logistic回歸因分析顯示，血PEDF水平是發(fā)生CMBs的獨立危險因素。眾所周知，PEDF具有抗炎和抗氧化作用[9]，抑制內皮功能障礙的發(fā)生發(fā)展，相關研究認為內皮功能障礙可能是CMBs發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，是腦小血管病的根本[10]，因此推測PEDF可能通過抑制內皮功能障礙的發(fā)生從而抑制CMBs的發(fā)生，由于PEDF的降低導致內皮功能障礙的抑制作用降低導致微出血的發(fā)生。

本研究提示，2組間年齡、空腹血糖、同型半胱氨酸、血清PEDF濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。目前，相關研究認為，血同型半胱氨酸與腦小血管病的發(fā)生密切相關[11]，本研究中單因素分析顯示其在CMBs組與健康對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但多因素非條件Logistic回歸因分析顯示血同型半胱氨酸并不是CMBs發(fā)生的獨立危險因素。

在PEDF基因多態(tài)性的相關研究中，有學者發(fā)現(xiàn)，PEDF-rs12948385與視網膜微小血管相關[12-13]。而CMBs同屬于微小血管疾病，目前關于CMBs與PEDF-rs12948385d的相關性目前尚無報道。rs12948385是PEDF基因轉錄起始點上游358 bp處存在的G→A突變，CMBs組攜帶A基因的頻率高于健康對照組。在校正年齡、性別及空腹血糖后，與GG基因型相比，GA+AA基因型發(fā)生CMBs的風險高，且GA+AA基因型發(fā)生CMBs的風險是GG型基因的6.271倍。

血PEDF濃度及其啟動子區(qū)基因多態(tài)性與腦微出血的發(fā)生可能存在相關性，但本研究為單中心研究，樣本量相對有限，易產生測量偏倚，且目前關于PEDF與CMBs的相關研究尚無相關報道，我們的研究需要進一步驗證。