石 光 孫 瑩 張 肖 焦建軍 武艷霞

非綜合征唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）是臨床常見遺傳性缺陷疾病，為單純性唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的總稱，我國(guó)新生兒中發(fā)病率約為1.62‰[1]。大量文獻(xiàn)表明，遺傳基因、環(huán)境等因素均可誘發(fā)該病的發(fā)生[2，3]。其中，IRF6 基因在雙側(cè)腭突的接觸期及融合期發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究報(bào)道NSCL/P 患兒中，其IRF6基因位點(diǎn)rs642961 多態(tài)性異于常人[4，5]。本研究對(duì)影響唇裂發(fā)生因素進(jìn)行分析，為臨床中NSCL/P 的治療與預(yù)防提供有效依據(jù)。

資料和方法

通過收集邯鄲地區(qū)2016 年3 月～2018 年4 月產(chǎn)科新生兒22460 例臨床資料進(jìn)行回顧性分析，患兒父親22240 例，患兒母親22460 例，完整核心家庭22230 個(gè)。①納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患兒均為邯鄲地區(qū)漢族人群；根據(jù)《中國(guó)婦幼衛(wèi)生監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》出生缺陷診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所有NSCL/P 患兒進(jìn)行診斷；本研究均醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家屬均簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心、肝、腎功能疾病者；合并嚴(yán)重免疫力缺陷者；中途退出研究者。

1.血標(biāo)本采集與DNA 提取：所有患兒均進(jìn)行外周靜脈血采集，采集量為10ml，加入2%EDTA 進(jìn)行抗凝，與-20℃下進(jìn)行保存，待檢。使用血樣DNA 提取試劑盒，由北京天根生化科技有限公司提供，提取基因組DNA 并保存于-20℃環(huán)境中，檢測(cè)DNA 純度并確保其達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，檢測(cè)工具為采用紫外分光光度計(jì)。

2.PCR 擴(kuò)增：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）進(jìn)行測(cè)IRF6 基因多態(tài)位點(diǎn)rs642961 基因型檢測(cè)。應(yīng)用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物、內(nèi)切酶。對(duì)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用限制性內(nèi)切酶MvaI 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳后進(jìn)行基因分型。隨機(jī)挑選10%的樣本進(jìn)行測(cè)序，保證驗(yàn)證基因分型的正確性，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照以驗(yàn)證酶切基因分型的正確性。對(duì)所有患兒及其父母進(jìn)行HW（Hardy-Weinberg）平衡檢驗(yàn)，其中，泳道 1、2 為純合子 AA，泳道 3、4 為雜合子 GA，泳道 5為純合子GG。

3.觀察指標(biāo)：所有入選患兒及其雙親均進(jìn)行問卷調(diào)查，并填寫《非綜合征型唇腭裂患兒環(huán)境因素調(diào)查表》，根據(jù)是否患NSCL/P 進(jìn)行分組，分為NSCL/P組與健康組。對(duì)所有患兒母親生理情況及孕期生活狀況進(jìn)行記錄，主要包括：吸煙史、流產(chǎn)史、妊娠期患病史（主要為病毒感染）、妊娠期服藥史（主要包擴(kuò)抗生素類、激素類、抗病毒類等），飲酒史等。記錄患兒父親生活狀況，包括吸煙、飲酒史等。采用單因素與多因素Logistic 回歸分析影響新生兒患者出現(xiàn)NSCL/P 的相關(guān)危險(xiǎn)因素。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率和構(gòu)成比進(jìn)行描述，采用χ2檢驗(yàn)。采用單因素與多因素Logistic 回歸分析影響新生兒患者出現(xiàn)NSCL/P 的相關(guān)危險(xiǎn)因素，以α 值雙側(cè)取0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

一般資料比較：查看所有入選患兒臨床資料與《非綜合征型唇腭裂患兒環(huán)境因素調(diào)查表》，根據(jù)《中國(guó)婦幼衛(wèi)生監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》出生缺陷診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有患兒進(jìn)行診斷，在22460 例新生兒中，NSCL/P 有48 例，占比 2.13‰，其中，單純性唇裂 15 例，占比31.25%，腭裂 12 例，占比 25.00%，唇腭裂 21 例，占比33.33%。兩組新生兒中，體重、孕周、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

兩組患兒HW 平衡檢驗(yàn)比較：所有患兒及其父母與健康組基因型頻率分布經(jīng)檢驗(yàn)均符合HW 平衡，NSCL/P 組中單純性唇裂與唇腭裂rs642961 位點(diǎn)的AA 基因頻率明顯高于健康組，數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患兒HW 平衡檢驗(yàn)比較（例）

影響新生兒發(fā)生NSCL/P 非條件單因素Logistic回歸分析：父親吸煙、母親吸煙、母親被動(dòng)吸煙、母親孕期具有疾病史與服藥史、未補(bǔ)充維生素與葉酸等環(huán)境因素是影響新生兒發(fā)生NSCL/P 的單因素（P＜0.05），詳見表2。

影響新生兒發(fā)生NSCL/P 非條件多因素Logistic回歸分析：母親吸煙、母親被動(dòng)吸煙、母親孕期具有疾病史與服藥史、未補(bǔ)充維生素與葉酸等環(huán)境因素是影響新生兒發(fā)生NSCL/P 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），詳見表3。

表2 發(fā)生NSCL/P 環(huán)境因素非條件單因素Logistic回歸分析

表3 影響人工流產(chǎn)患者發(fā)生RAAS非條件多因素Logistic 回歸分析

討 論

唇腭裂是常見先天性發(fā)育畸形類疾病，在患兒生長(zhǎng)發(fā)育過程重對(duì)患兒身心健康造成一定負(fù)面影響[6，7]。臨床上將其分為綜合性唇裂（SCL/P）與 NSCL/P，其中，NSCL/P 占所有唇腭裂的 50～60%[8，9]。大量文獻(xiàn)表明，NSCL/P 是由于多種基因與環(huán)境因素聯(lián)合交互所致，隨著基因研究發(fā)展，關(guān)于NSCL/P 基因定位成為該疾病中重要的研究?jī)?nèi)容[10，11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，IRF6 是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)與NSCL/P 發(fā)病密切相關(guān)的基因，IRF6 位點(diǎn)的變異是誘發(fā)NSCL/P 的重要因素[12]。此外，有研究報(bào)道，融合腭的中間邊緣，發(fā)囊，牙蕾，生殖器以及皮膚中IRF6 表達(dá)水平較高，間接提示，IRF6 與 NSCL/P 發(fā)病密切相關(guān)[13，14]。李泓運(yùn)[15]等研究認(rèn)為，在遺傳基因?qū)W中，由于IRF6 基因突變而引起NSCL/P 發(fā)病概率高達(dá)12%。但又有學(xué)者認(rèn)為，基因多由于父母遺傳所得，其父母基因中帶有誘發(fā)NSCL/P 的發(fā)病成份，但未有研究證明，父母基因的遺傳是導(dǎo)致NSCL/P 發(fā)病的危險(xiǎn)因素[16]。

本研究中結(jié)果顯示，在所有入選新生兒中，NSCL/P 發(fā)病率為2.13‰。HW 平衡檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NSCL/P 組中單純性唇裂與唇腭裂rs642961 位點(diǎn)的AA 基因頻率明顯高于健康組，表明，rs642961 位點(diǎn)的AA 基因是誘發(fā)NSCL/P 的危險(xiǎn)基因型，有研究報(bào)道，脊椎動(dòng)物中IRF6 基因增強(qiáng)子區(qū)內(nèi)的rs642961高度保守，rs642961（G＞A）可能對(duì) AP-2α 的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了改變，而AP-2α 是顱面部生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)顱面部組織生長(zhǎng)發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用，AP-2α 的突變可誘發(fā)鰓- 眼- 面綜合征的發(fā)生[17，18]。此外，AP-2α 結(jié)合位點(diǎn)改變后直接影響遺傳過程中IRF6 基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而引起面部發(fā)育不完全，誘發(fā)NSCL/P 的發(fā)生[19]。經(jīng)Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)在影響新生兒出現(xiàn)NSCL/P 的環(huán)境因素中，父親吸煙、母親吸煙、母親被動(dòng)吸煙、母親孕期具有疾病史與服藥史、未補(bǔ)充維生素與葉酸等環(huán)境因素是影響新生兒發(fā)生NSCL/P 的單因素，該環(huán)境因素下，新生兒發(fā)生NSCL/P 的幾率明顯增高。其中，母親吸煙、母親被動(dòng)吸煙、母親孕期具有疾病史與服藥史、未補(bǔ)充維生素與葉酸等環(huán)境因素是影響新生兒發(fā)生NSCL/P 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究報(bào)道，長(zhǎng)期吸煙史與被動(dòng)吸煙可引起妊娠期胎兒的發(fā)育異常[20]。此外，孕期疾病史與服藥史可直接或間接誘發(fā)NSCL/P 的發(fā)生，其中感染性疾病、傳染性疾病是誘發(fā)該病的主要類型，抗生素、解熱鎮(zhèn)痛藥、激素類藥物可提高該病的發(fā)病率，且有大量研究表明，孕期用藥導(dǎo)致胎兒畸形已被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)[21]。維生素與葉酸是胎兒在發(fā)育過程中所必需因素，在由于缺乏維生素與葉酸所導(dǎo)致的NSCL/P 中，推斷原因可能由于在胎兒發(fā)育過程中，維生素與葉酸可促進(jìn)胎兒面部組織發(fā)育，從而防止NSCL/P 的發(fā)生。