高寧，劉博，王博，南洋，程玉鵬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

花椒在我國應(yīng)用歷史悠久，是典型的藥食同源植物，其不僅是日常生活中最為常見的調(diào)味品，同時(shí)也是祖國醫(yī)藥寶庫中重要的傳統(tǒng)中藥?；ń穼僦参镌谑澜绶秶鷥?nèi)共約250種，我國分布有45種[1]。我國花椒種植歷史悠久，分布廣泛，四川漢源、陜西韓城、鳳縣、山西芮城、重慶江津等地均為我國花椒的重要產(chǎn)區(qū)。近年來，隨著市場需求的增加，我國花椒產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，種植規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大，花椒的風(fēng)味物質(zhì)分析[2]、良種選育[3]、采收加工[4]、質(zhì)量鑒定[5]等方面的研究也取得了諸多成果。然而，目前花椒主要是作為調(diào)味品直接食用，其深加工產(chǎn)業(yè)尚處于起步階段，同時(shí)其藥用價(jià)值的開發(fā)也缺少深入的作用機(jī)理研究。2015版《中國藥典》記載花椒性溫，味辛，歸脾、胃、腎經(jīng)，具有溫中止痛，殺蟲止癢的功效。藥典所載其用藥部位為蕓香科植物青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.)或花椒(ZantohxylumbungeanumMaxin.)的干燥成熟果皮[6]。研究表明，花椒含有揮發(fā)油類、生物堿類、香豆素類等多種成分，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等均有較好療效[7]。特別是對(duì)心血管系統(tǒng)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，花椒能夠擴(kuò)張血管、降壓降脂、預(yù)防血栓、保護(hù)心肌，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景[8]?，F(xiàn)階段花椒藥用價(jià)值的研究多集中于特定藥效的確認(rèn)，其改善心血管系統(tǒng)功能的分子機(jī)制尚不清晰。

基因芯片技術(shù)基于分子雜交原理，利用芯片上固定的核酸探針能夠一次性檢測幾萬個(gè)基因的表達(dá)量變化，是轉(zhuǎn)錄組研究的重要手段之一。利用基因芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析手段，能夠快速有效的篩選出差異基因所涉及的生物學(xué)功能及參與的信號(hào)途徑，在疾病檢測[9]、發(fā)病機(jī)理研究[10]、中藥作用機(jī)制研究[11]等方面發(fā)揮了重要作用。因此，本研究利用基因芯片技術(shù)檢測了大鼠灌胃花椒前后基因表達(dá)差異，并采用生物信息學(xué)手段分析其對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)理，為深入開發(fā)花椒的藥用價(jià)值提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用花椒購自哈爾濱世一堂藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定符合2015版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定。

花椒水煎液的制備：取花椒稱重，加入10倍量蒸餾水浸泡1 h，加熱，微沸煎煮1 h，過濾得藥液，濾渣加入8倍量蒸餾水，重新煎煮1 h，過濾，合并2次藥液，濃縮成終濃度為0.2 g·mL-1生藥量的花椒水煎液。

基因芯片采用美國Agilent公司Agilent Rat Gene Expression(8*60 K)大鼠基因芯片(Agilent，Design ID：028279)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

美國Agilent G2 545 A雜交爐；美國AgilentG2050C芯片掃描儀；美國Thermo NanoDrop核酸分析儀；美國Bio-Rad T100 PCR儀；德國Eppendorf 5418R低溫離心機(jī)，德國Eppendorf ThermoMixer C恒溫混勻儀。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重160～200 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK黑2017004。動(dòng)物日常護(hù)理及試驗(yàn)條件均符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥與組織樣品處理

將SD大鼠隨機(jī)分為空白組與花椒給藥組，每組10只，共計(jì)20只。采用灌胃給藥方式每天上午對(duì)花椒給藥組大鼠喂食花椒水煎液，最終給藥量為8.4 g·kg-1(生藥量/體重)，空白組灌胃同體積生理鹽水，連續(xù)給藥21 d，自由進(jìn)食飲水。給藥結(jié)束后，處死大鼠，迅速取出肝臟并浸入液氮冷凍，取部分肝組織用于總RNA的提取，其它部分置于-80 ℃保存。

切取部分大鼠肝臟放入液氮并研磨，采用mirVanaTM RNA Isolation Kit試劑盒(Applied Biosystems公司)提取大鼠肝臟總RNA，得到空白組大鼠肝臟總RNA與花椒給藥組大鼠肝臟總RNA。利用核酸分析儀檢測各組RNA濃度并進(jìn)行定量，并利用Agilent Bioanalyzer 2100檢測RNA完整性。(要求：核酸分析儀檢測A260/A280在1.9～2.2之間，且Agilent Bioanalyzer 2100檢測28S/18S值大于0.7、2100RIN值大于7.0，視為合格。)

1.2.2 基因表達(dá)檢測與差異基因篩選

經(jīng)檢驗(yàn)合格的RNA進(jìn)一步純化后逆轉(zhuǎn)錄形成雙鏈cDNA，隨后合成Cyanine-3-CTP標(biāo)記的cRNA并與基因芯片雜交，洗脫后得到基因芯片雜交信號(hào)圖像，運(yùn)用Feature Extraction提取原始數(shù)據(jù)，隨后利用Genespring對(duì)原始雜交信號(hào)進(jìn)行歸一化處理，比較花椒給藥組與空白組基因表達(dá)信號(hào)，以上調(diào)或下調(diào)2倍作為閾值，篩選差異基因。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

將差異基因上傳至生物信息數(shù)據(jù)分析平臺(tái)IPA(Ingenuity Pathway Analysis，http://www.ingenuity.com)，以心血管系統(tǒng)功能為焦點(diǎn)，利用IPA分析差異基因的生物功能(Bio-function模塊)及其參與的信號(hào)通路(Canonical Pathway模塊)，從轉(zhuǎn)錄組水平探討花椒改善心血管系統(tǒng)功能的分子機(jī)理。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

生物信息分析結(jié)果采用Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher's exact test)分析，統(tǒng)計(jì)顯著性設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與差異基因篩選結(jié)果

采用核酸分析儀通過A260/A280的值檢測各組總RNA的純度并對(duì)提取得到的總RNA進(jìn)行定量，結(jié)果表明，各組總RNA樣品的A260/A280均在1.9～2.2之間，說明總RNA純度良好，Agilent Bioanalyzer 2100檢測結(jié)果表明28S/18S均大于0.7，2100RIN值均大于7.0，檢測圖譜清晰，無拖尾現(xiàn)象，表明總RNA完整無降解(圖1，表1)?；蛐酒s交掃面圖像斑點(diǎn)清晰、密度均勻，原始數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，以2倍作為閾值，利用FoldChange進(jìn)行差異基因篩選，結(jié)果表明，花椒給藥組與空白組相比較，共有1 429條基因發(fā)生表達(dá)量變化，其中表達(dá)量上調(diào)的基因有791條，而表達(dá)量下調(diào)的基因共有638條(圖2)。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 花椒調(diào)節(jié)的心血管系統(tǒng)功能

將差異基因?qū)隝PA在線分析數(shù)據(jù)庫，通過Bio function模塊分析發(fā)現(xiàn)，花椒給藥組與空白組比較所得差異基因中涉及心血管系統(tǒng)功能的基因共有111條，聚類于37個(gè)生物功能中，涉及多種心血管系統(tǒng)疾病，如高血壓、血栓形成、心絞痛、心律失常等，與已有研究報(bào)道相吻合[12]。心血管系統(tǒng)相關(guān)的富集顯著性前10位的生物功能如表2。

A.各樣品總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100檢測所得電泳圖；B.各樣品總RNA經(jīng)Agilent檢測所得峰值圖。其中：Ladder代表標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker；GN0代表空白組，GN6代表花椒給藥組

表2 花椒給藥組差異基因富集顯著性前10位的心血管相關(guān)Bio Function

Table 2 Top 10 enrichment of cardiovascular system related Bio Function

2.2.2 花椒影響的心血管系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路

將差異基因?qū)隝PA在線分析數(shù)據(jù)庫，利用Canonical Pathway模塊分析花椒對(duì)大鼠代謝及信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有32條信號(hào)途徑得到富集，其中與心血管系統(tǒng)功能密切相關(guān)的信號(hào)通路有7條，其中上調(diào)的通路包括心血管系統(tǒng)中的NO信號(hào)(Nitric Oxide Signaling in the Cardiovascular System)、多巴胺受體信號(hào)(Dopamine Receptor Signaling)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素信號(hào)(Corticotropin Releasing Hormone Signaling)和β腎上腺素能信號(hào)(Cardiac β-adrenergic Signaling)；下調(diào)的通路包括內(nèi)皮素-1信號(hào)(Endothein-1 Signaling)與血管內(nèi)皮生長因子家族配體受體相互作用(VEGF Family Ligand-receptor Interactions)；而心臟發(fā)生促進(jìn)因子(Factors Promoting Cardiogenesis in Vertebrates)的調(diào)節(jié)趨勢不明顯(圖3)。

3 討論

花椒是典型的藥食同源性調(diào)味品，具有廣泛的應(yīng)用范圍，在人們?nèi)粘ｏ嬍撑c臨床用藥中均具有重要作用，特別是對(duì)心血管系統(tǒng)疾病表現(xiàn)出良好的治療效果。本研究利用生物信息學(xué)手段分析了花椒給藥組與空白組大鼠間的差異基因，對(duì)其涉及的生物學(xué)功能及信號(hào)途徑進(jìn)行了富集分析，探討其改善心血管系統(tǒng)的分子機(jī)制。結(jié)果表明，共篩選得到111條與心血管系統(tǒng)相關(guān)差異基因，共富集于高血壓、血栓形成、心絞痛等37個(gè)生物學(xué)功能，信號(hào)通路分析則表明，內(nèi)皮素-1信號(hào)等信號(hào)通路在花椒治療心血管系統(tǒng)疾病過程中可能發(fā)揮重要作用。

內(nèi)皮素(endothein，ET)家族共包含3種多肽，ET-1、ET-2與ET-3，其中ET-1是主要活性物質(zhì)，是維持血管張力的重要物質(zhì)[13]。內(nèi)皮細(xì)胞生成的大部分ET-1通過血管壁的基底側(cè)擴(kuò)散并與平滑肌細(xì)胞上的捏皮素受體結(jié)合，最終導(dǎo)致血管收縮。研究表明，內(nèi)皮素能夠調(diào)節(jié)蛋白激酶C(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K/Akt)等多種信號(hào)途徑，影響機(jī)體心血管功能。體內(nèi)ET-1濃度的增加能夠強(qiáng)烈的提升血壓，ET-1還能夠促進(jìn)血管肥大并誘發(fā)局部炎癥，同時(shí)，ET-1及其信號(hào)調(diào)控還與肺動(dòng)脈高壓、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化等病理過程密切相關(guān)[14]。通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花椒抑制內(nèi)皮素-1信號(hào)(Endothein-1 Signaling)，這可能是其降血壓、保護(hù)心肌等作用的分子機(jī)制(圖3-B)。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物體重要的信號(hào)分子，主要由一氧化氮合酶催化產(chǎn)生，其在體內(nèi)能夠激活鳥苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cGMP，后者能夠激活一系列的蛋白磷酸化過程，發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)作用，調(diào)控多種生理生化反應(yīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，NO通路對(duì)于維持血壓穩(wěn)定、預(yù)防血栓、緩解血管內(nèi)皮損傷等均有重要作用，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等的發(fā)病均與NO信號(hào)途徑呈負(fù)相關(guān)[15]。通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花椒能夠促進(jìn)心血管系統(tǒng)中的NO信號(hào)(Nitric Oxide Signaling in the Cardiovascular System)，這可能是花椒降壓降脂、保護(hù)心肌、預(yù)防血栓的分子機(jī)制之一(圖3-C)。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一類同源二聚體糖蛋白，其主要生理功能表現(xiàn)為促進(jìn)血管生成、增加血管通透性以及影響血流動(dòng)力學(xué)。目前人體VEGF家族共發(fā)現(xiàn)VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、以及胎盤生長因子(PGF)5類成員；其受體屬酪氨酸激酶受體，包括VEGFR-1、VEGFR-2與VEGFR-3。現(xiàn)有研究報(bào)道顯示，VEGF表達(dá)量與深靜脈血栓形成、自發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等均呈正相關(guān)[16]。通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花椒能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子家族配體受體相互作用(VEGF Family Ligand-receptor Interactions)，這可能部分解釋花椒降壓降脂、預(yù)防血栓的藥理作用(圖3-D)。

此外，通路分析表明花椒能夠促進(jìn)多巴胺受體信號(hào)(Dopamine Receptor Signaling)，而相應(yīng)的多巴胺受體能夠通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞活性達(dá)到防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用[17]，這也與花椒降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的報(bào)道吻合[18](圖3-E)。

A.心血管系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路富集結(jié)果；B.內(nèi)皮素-1信號(hào)；C.心血管系統(tǒng)中的NO信號(hào)；D.VEGF家族配體受體相互作用；E.多巴胺受體信號(hào)

4 結(jié)論

綜上可知，花椒能夠調(diào)控與高血壓、血栓、心絞痛、心律失常等疾病相關(guān)的基因表達(dá)，其能夠通過抑制內(nèi)皮素-1信號(hào)與血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)、促進(jìn)NO信號(hào)與多巴胺受體信號(hào)來發(fā)揮治療心血管系統(tǒng)疾病的藥效作用，研究結(jié)果為深入了解花椒調(diào)控心血管系統(tǒng)的分子機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)與試驗(yàn)參考。