談美霞，李文帥，武國瑞，王敏，杜維俊，岳愛琴*，趙晉忠*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

大豆皂苷是大豆種子中一類重要的次生代謝產(chǎn)物[1]。大豆皂苷主要分為A類、DDMP類、B類和E類4類[2, 3]。A類大豆皂苷是以大豆皂醇A為配基，而DDMP類、B類和E類是以大豆皂醇B為配基[4, 5]。研究表明A類皂苷末端糖基乙?；瘜?dǎo)致大豆及其制品具有苦味和澀味[6]，而DDMP類、B類和E類皂苷具有降低膽固醇、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、抗血脂氧化、抗炎以及抗HIV病毒等多種對人體有益的生理功能[7～9]。因此，A類皂苷的缺失可以改進(jìn)大豆及其豆制品的品質(zhì)。Takada等[10～12]通過對日本種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，篩選出一個缺失A類大豆皂苷的突變體材料，進(jìn)一步研究表明由隱性等位基因sg-5控制。Yano等研究者圖位克隆GmSg-5基因，該基因編碼一種細(xì)胞色素P450酶CYP72A69，CYP72A69可以將大豆皂醇B的21位羥基化形成大豆皂醇A[13]。Rehman等[14, 15]通過比對GmSg-5基因和突變體中Gmsg-5基因序列共發(fā)現(xiàn)4個SNP位點(diǎn)引起氨基酸變化，其中第1 127位點(diǎn)G→A變異導(dǎo)致CYP72A69第376位氨基酸由精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，使其喪失將大豆皂醇B的21位羥基化形成大豆皂醇A的功能，從而使大豆材料不能合成A類大豆皂苷。

傳統(tǒng)檢測單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphis，SNP)的方法有直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性、擴(kuò)增產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶酶切多態(tài)性、等位基因特異PCR技術(shù)等[16]。直接測序法直觀、準(zhǔn)確性高，但周期長、費(fèi)用高；后3種方法特異性低，并不適用于所有單核苷酸多態(tài)性的檢測，而且均需要瓊脂糖凝膠電泳法，操作繁瑣，容易發(fā)生交叉污染，因此，亟需建立一套簡便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的SNP檢測方法，以滿足大豆分子標(biāo)記輔助選擇育種的需求。唐卓課題組開發(fā)了基于DNAzyme的缺口-連接酶鏈反應(yīng)(gap ligase chain reaction，Gap-LCR)可視化SNP檢測技術(shù)，并應(yīng)用于鐮刀形貧血基因突變位點(diǎn)的檢測。該技術(shù)利用Gap-LCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)DNA，將DNAzyme序列引入連接產(chǎn)物中，然后利用 Lambda Exonuclease降解沒有參與連接反應(yīng)的磷酸化探針，及Exonuclease III釋放DNAzyme，釋放的DNAzyme和卟啉鐵(hemin)結(jié)合后可以形成具有過氧化物酶活性的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，可以使顯色底物ABTS氧化為綠色的ABTS+，因此可以直接在室溫下通過顏色變化來檢測單核苷酸多態(tài)性[17～22]。Gap-LCR相較于傳統(tǒng)SNP檢測技術(shù)，具有較高的特異性和靈敏度、檢測時間短、不需要依賴精密的儀器、不需要通過電泳來檢測等優(yōu)點(diǎn)。

本文基于DNAzyme的Gap-LCR反應(yīng)檢測SNP的方法，分別設(shè)計(jì)了GmSg-5/Gmsg-5基因的特異探針，建立鑒定A類大豆皂苷缺失材料特異性的可視化快速檢測方法，為今后快速篩選A類皂苷缺失大豆材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)試劑和儀器

1.1.1 試驗(yàn)試劑

9°N DNA Ligase、Klenow Fragment、Lambda Exonuclease及Exonuclease III均購買于NEB(New England Biolabs)。ATP購買于美國Thermo公司。dTTP、ABTS、hemin均購買于北京索萊寶科技有限公司。dNTP購買于北京全式金生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

PCR儀(Mastercycler nexus GX2，德國Eppendorf)；熒光定量PCR儀(CFX96 Touch，美國Bio-RAD)；電泳儀(powerpac Basic，美國Bio-RAD)；全自動凝膠成像系統(tǒng)(GeneGenius，英國Syngene)；核酸蛋白檢測儀(BioSpectrometer kinetic，德國Eppendorf)；數(shù)碼單反相機(jī)(EOS 70D，中國Canon)；電子分析天平(MSA3.6P-OCE-DM，德國Sartorius)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 探針設(shè)計(jì)

參照NCBI公布的GmSg-5/Gmsg-5基因序列差異，設(shè)計(jì)了鑒定Gmsg-5/GmSg-5基因第1 127位點(diǎn)G/A變異的Gap-LCR反應(yīng)特異探針，如表1。目標(biāo)DNA序列及探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 Gap-LCR反應(yīng)體系條件及優(yōu)化

Gap-LCR反應(yīng)總體積50 μL，其中5×LCR buffer10 μL[100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.4、100 mmol·L-1KCl、50 mmol·L-1(NH4)2SO4、10 mmol·L-1MgSO4]，L、R、Ln、Rn探針各6 μL(10 μmol·L-1)，1 μL dTTP(1 mmol·L-1)，0.3 μL ATP(100 mmol·L-1)，0.02 μL 9°N DNA ligase(40 000 U), 0.02 μL Klenow Fragment(5 000 U)，1 μLGmSg-5或Gmsg-5(10 μmol·L-1)，剩余用ddH2O補(bǔ)足。Gap-LCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 4 min，35個循環(huán)，10 ℃保存。

表1 GmSg-5/Gmsg-5基因Gap-LCR反應(yīng)所涉及的探針和目標(biāo)序列

注：與GmSg-5相比，Gmsg-5中的下劃線和加粗堿基A是突變位點(diǎn)。探針L、R、Ln和Rn與Gmsg-5相同或互補(bǔ)，僅具有單個堿基空位。探針L*、R、Ln和Rn*與GmSg-5相同或互補(bǔ)，僅具有單個堿基空位。探針R的下劃線和斜體堿基指DNAzyme序列

模板濃度優(yōu)化：在其他條件不變的情況下，通過改變50 μL Gap-LCR反應(yīng)體系中加入的模板的量考察了4個模板濃度對反應(yīng)結(jié)果的影響，分別是0、0.1、0.2、0.3 μmol·L-1。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇最優(yōu)的模板濃度。

緩沖溶液pH值優(yōu)化：考察了7個緩沖溶液pH值(7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0)。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和比色檢測記錄，選擇最優(yōu)的pH值。

探針濃度優(yōu)化：在其他條件不變的情況下，通過改變50 μL Gap-LCR反應(yīng)體系中加入的探針的量考察了4個探針濃度對反應(yīng)結(jié)果的影響，分別是0.8、1.0、1.2、1.4 μmol·L-1。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇最優(yōu)的探針濃度。

1.2.3 Gap-LCR可視化體系

首先取10 μL PCR產(chǎn)物、10 μL ddH2O、2.5 μL 5×LCR buffer、1 μL Anti-G(10 μmol·L-1)和0.8 μL NaCl(3 mol·L-1)，混勻，94 ℃加熱1 min，冷至室溫；然后向反應(yīng)體系中加入1 μL Lambda Exonuclease(5 000 U)，37 ℃孵育60 min，85 ℃加熱15 min使 Lambda Exonuclease失活，冷至室溫；然后在混合體系中加0.5 μL Exonuclease Ⅲ(100 000 U)，37 ℃孵育5 min，70 ℃加熱20 min，冷至室溫。經(jīng)過以上處理后的混合溶液中加2.4 μL hemin(50 μmol·L-1)、1.27 μL ABTS(60 μmol·L-1)和0.6 μL H2O2(50 mmol·L-1)，10 min左右觀察顏色變化或在核酸蛋白檢測儀上測定420 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmSg-5/Gmsg-5基因Gap-LCR特異探針的設(shè)計(jì)

下載NCBI網(wǎng)站中的GmSg-5(MF624839.1)和Gmsg-5(LC143441.1)基因序列并進(jìn)行比對，比對結(jié)果(圖1)，發(fā)現(xiàn)第1 127位點(diǎn)存在G/A變異，該SNP位點(diǎn)導(dǎo)致CYP72A69第376位氨基酸由精氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔瑥亩勾蠖共牧现胁荒芎铣葾類大豆皂苷[14, 15]，依此SNP位點(diǎn)的序列差異，根據(jù)Gap-LCR反應(yīng)原理設(shè)計(jì)了Gap-LCR方法檢測Gmsg-5基因的一套特異探針L、R、Ln、Rn(圖2)。為了增加試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，避免假陽性，同步設(shè)計(jì)檢測GmSg-5基因的一套互補(bǔ)特異探針L*、R、Ln、Rn*，以獲得與前者相反的結(jié)果，兩套探針相互驗(yàn)證。本試驗(yàn)的反應(yīng)原理如圖2所示。

圖1 GmSg-5/Gmsg-5基因序列比對圖

2.2 Gap-LCR檢測Gmsg-5基因反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 Gap-LCR反應(yīng)模板濃度的優(yōu)化

考察模板濃度對Gap-LCR反應(yīng)體系的影響，從圖3可以看出，第2、3、4、5泳道均有L+R/Ln+Rn、R/Rn和L/Ln 3條帶，第4泳道的目標(biāo)條帶L+R/Ln+Rn亮度最高，因此選擇0.2 μmol·L-1模板濃度作為Gap-LCR反應(yīng)最佳條件。

2.2.2 Gap-LCR反應(yīng)緩沖溶液pH值的優(yōu)化

考察緩沖溶液pH值對Gap-LCR反應(yīng)體系的影響，從圖4A可以看出第1～7泳道均出現(xiàn)L+R/Ln+Rn、R/Rn和L/Ln 3條帶，但第4泳道pH為8.4時目標(biāo)帶L+R/Ln+Rn亮度最高；比色檢測結(jié)果如圖4B也可以看出第4管pH為8.4顏色最深，因此選擇pH8.4為Gap-LCR反應(yīng)緩沖液最佳pH值。

2.2.3 Gap-LCR反應(yīng)探針濃度的優(yōu)化

考察探針濃度對Gap-LCR反應(yīng)體系的影響，從圖5可以看出第4泳道探針濃度為1.2 μmol·L-1時目標(biāo)帶L+R/Ln+Rn亮度最高，且副產(chǎn)物R/Rn和L/Ln少，因此選擇探針濃度1.2 μmol·L-1為Gap-LCR反應(yīng)最佳反應(yīng)條件。

2.2.4GmSg-5/Gmsg-5基因互補(bǔ)探針Gap-LCR反應(yīng)

為了避免檢測結(jié)果的假陽性，分別根據(jù)GmSg-5和Gmsg-5序列差異設(shè)計(jì)2套互補(bǔ)探針，即基于Gmsg-5序列的一套探針L、R、Ln、Rn和基于GmSg-5序列的一套探針L*、R、Ln、Rn*。利用以上Gap-LCR優(yōu)化反應(yīng)體系分別加入兩套探針進(jìn)行Gap-LCR反應(yīng)，結(jié)果如圖6。由圖6可以看出，第2、3泳道Gap-LCR反應(yīng)體系中加入的目標(biāo)片段均為Gmsg-5，分別加入兩套探針L*、R、Ln、Rn*(第2泳道)和L、R、Ln、Rn(第3泳道)，第2泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶L*+R/Ln+Rn*，而第3泳道沒有目標(biāo)帶；第5、6泳道Gap-LCR反應(yīng)體系中加入目標(biāo)片段均為Gmsg-5，分別加入2套探針L*、R、Ln、Rn*(第5泳道)和L、R、Ln、Rn(第6泳道)，得到相反的結(jié)果，第5泳道沒有目標(biāo)帶，而第6泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶L+R/Ln+Rn。本試驗(yàn)結(jié)果表明在Gap-LCR優(yōu)化體系條件下，基于GmSg-5/Gmsg-5序列的2套探針L、R、Ln、Rn和L*、R、Ln、Rn*能夠特異性的分別識別Gmsg-5和GmSg-5序列。

圖2 基于DNAzyme的Gap-LCR反應(yīng)檢測Gmsg-5基因的原理

M：50 bp DNA Marker；1：加L、R引物的普通PCR擴(kuò)增Gmsg-5基因片段；2～5：模板濃度分別為0、0.1、0.2、0.3 μmol·L-1

M：50 bp DNA Marker；1～7：緩沖溶液pH分別為7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0

M：50 bp DNA Marker；1：加L、R引物的普通 PCR擴(kuò)增Gmsg-5基因片段；2～5：探針濃度分別為0.8、1.0、1.2、1.4 μmol·L-1

M：50 bp DNA Marker；1：用L、R引物PCR擴(kuò)增Gmsg-5基因片段；2：模板GmSg-5和探針L*、R、Ln、Rn*；3：模板GmSg-5和探針L、R、Ln、Rn；4：空白對照；5：模板Gmsg-5和探針L*、R、Ln、Rn*；6：模板Gmsg-5和探針L、R、Ln、Rn

2.3 基于DNAzyme的Gap-LCR反應(yīng)鑒定GmSg-5/Gmsg-5基因的顯色反應(yīng)

由于Gap-LCR反應(yīng)時設(shè)計(jì)的探針R序列中引入DNAzyme序列，因此反應(yīng)結(jié)果的檢測可以利用DNAzyme的特性來進(jìn)行SNP 的可視化檢測，而不需瓊脂糖凝膠電泳。

顯色反應(yīng)前需要在Gap-LCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入Lambda Exonuclease將未參加反應(yīng)的探針R/Rn和L/Ln或R/Rn*和L*/Ln消去，加入Exonuclease Ⅲ消化互補(bǔ)鏈Ln+Rn或Ln+Rn*將Gap-LCR產(chǎn)物的DNAzyme序列釋放出來。結(jié)果如圖7 A所示，Gap-LCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Lambda Exonuclease和Exonuclease Ⅲ消化后，僅第2、6泳道有一條帶L*+R(第2泳道)或L+R(第6泳道)，說明經(jīng)過Lambda Exonuclease和ExonucleaseⅢ消化后，能夠完全釋放含有DNAzyme目標(biāo)片段序列釋放出來，并且將多余探針形成R/Rn和L/Ln或R/Rn*和L*/Ln全部消化掉，為下一步顯色反應(yīng)做好準(zhǔn)備。

將酶切反應(yīng)后的體系中加入hemin、ABTS和H2O2進(jìn)行顯色反應(yīng)，結(jié)果如圖7B所示，添加模板GmSg-5和探針L*、R、Ln、Rn*(管2)、模板Gmsg-5和探針L、R、Ln、Rn(管6)的反應(yīng)管顯綠色，而添加模板GmSg-5和探針L、R、Ln、Rn(管3)、模板Gmsg-5和探針L*、R、Ln、Rn*(管5)、空白對照(管4)均不顯色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基于DNAzyme的Gap-LCR反應(yīng)的可視化檢測體系可以簡便快捷、準(zhǔn)確應(yīng)用于等位基因Gmsg-5/GmSg-5的SNP的檢測，從基因水平上快速準(zhǔn)確鑒定出A類皂苷缺失的大豆材料。

M：50 bp DNA Marker；1：用L、R引物PCR擴(kuò)增Gmsg-5基因片段；2：模板GmSg-5和探針L*、R、Ln、Rn*；3：模板GmSg-5和探針L、R、Ln、Rn；4：空白對照；5：模板Gmsg-5和探針L*、R、Ln、Rn*；6：模板Gmsg-5和探針L、R、Ln、Rn

另外對顯色反應(yīng)的時間進(jìn)行了研究，從圖8可以看出，0～10 min顯色液吸光度值不斷增加，10 min吸光度值達(dá)到最大，顯色反應(yīng)10 min后吸光度值又不斷減小，說明顯色反應(yīng)10 min為最佳可視化檢測觀察時間。

圖8 顯色反應(yīng)體系吸光度隨反應(yīng)時間增加的變化情況

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)有直接分析檢測大豆A類皂苷類型的方法主要包括：薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography，TLC)[23]、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)[24, 25]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-tandern Mass Spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS)[26]。TLC法可以對大豆皂苷組成進(jìn)行快速篩選，但是不夠精確；HPLC和HPLC-ESI-MS/MS克服了薄層色譜法缺點(diǎn)，但使用儀器價(jià)格昂貴、運(yùn)行成本高、費(fèi)時，很難用于大量大豆種質(zhì)資源的篩選。因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)檢測A類大豆皂苷缺失的方法。

近年來，大豆皂苷代謝途徑中的相關(guān)基因不斷被克隆，尤其是A類皂苷代謝的關(guān)鍵酶基因GmSg-5/Gmsg-5被克隆，為進(jìn)一步從基因水平檢測A類皂苷奠定了基礎(chǔ)[10～15]。本研究通過比對大豆A類皂苷關(guān)鍵酶基因GmSg-5/Gmsg-5基因序列，找出SNP位點(diǎn)，根據(jù)GmSg-5/Gmsg-5基因SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了GmSg-5/Gmsg-5基因的2套特異性互補(bǔ)探針L*、R、Ln、Rn*和L、R、Ln、Rn。同時優(yōu)化了Gap-LCR反應(yīng)體系，該體系在0.2 μmol·L-1模板濃度、緩沖液pH值8.4、探針濃度1.2 μmol·L-1條件效果最好，顯色反應(yīng)10 min即可分別實(shí)現(xiàn)對GmSg-5/Gmsg-5基因的檢測。Gap-LCR反應(yīng)體系中加入Gmsg-5基因的一套特異探針L、R、Ln、Rn，顯色反應(yīng)顯綠色；而加入GmSg-5基因的一套特異探針L*、R、Ln、Rn*顯色反應(yīng)不顯色說明該大豆材料不合成A類大豆皂苷，為A類皂苷缺失材料。

本研究建立的基于DNAzyme的Gap-LCR反應(yīng)檢測A類大豆皂苷缺失的可視化檢測方法，與直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性、擴(kuò)增產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶酶切多態(tài)性、等位基因特異PCR技術(shù)等從基因水平SNP檢測手段相比[16]，上述幾種方法均需要首先進(jìn)行普通PCR，而本研究所用的是Gap-LCR，由于Gap-LCR只添加幾個堿基，所以程序簡單省時，只需要變性和退火兩步。另外上述幾種方法擴(kuò)增結(jié)果的觀察均需采用瓊脂糖凝膠電泳法，操作繁瑣，容易發(fā)生交叉污染，特異性低，本研究在Gap-LCR擴(kuò)增體系的一個探針R的3′端引入了DNAzyme序列，可以直接在室溫下通過顏色變化來檢測單核苷酸多態(tài)性。Abravava等[27]比較了Gap-LCR與等位基因特異性PCR(ASPCR)在檢測HIV逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變體時的差異，證明Gap-LCR是一種靈敏而特異的擴(kuò)增技術(shù)，可以準(zhǔn)確檢測單堿基突變。不足之處是本研究建立的可視化檢測方法只能定性分析A類大豆皂苷的有無，不能進(jìn)行定量分析，要進(jìn)行定量分析還有待進(jìn)一步研究。

通過本研究建立了一種從基因水平上鑒定A類大豆皂苷缺失的可視化檢測方法，該方法快速、簡單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)。