王計平，安茜，段露露，趙熙寧，岳敏，崔紅利，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)是一種單細(xì)胞無細(xì)胞壁、耐鹽性極高的光自養(yǎng)真核綠藻，能在高光、高溫和高鹽等極端環(huán)境下大量積累類胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素含量可高達(dá)細(xì)胞干重的14%[1]。杜氏鹽藻還能富集藻多糖和油脂等高值化合物，是一種獨(dú)特、可商業(yè)化的優(yōu)質(zhì)生物資源。

類胡蘿卜素(carotenoids)是一種天然色素，可分為兩類，即碳?xì)渌妮祁惢衔?胡蘿卜素)和含氧衍生物(葉黃素)[2]。常見的類胡蘿卜素包括α-胡蘿卜素(α-carotene)、β-胡蘿卜素(β-carotene)、蝦青素(astaxanthin)、番茄紅素(lycopene)等[2]。類胡蘿卜素是一種親脂的萜類化合物，可溶于非極性有機(jī)溶劑，能與細(xì)胞膜發(fā)生特異性結(jié)合[3]。DNA序列比對研究發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻具有參與類胡蘿卜素合成兩條途徑即甲羥戊酸(mevalonic acid, MVA)途徑和甲基赤蘚糖醇(methylerythritol phosphate, MEP)途徑中的相關(guān)酶基因[4]。因此，一般認(rèn)為杜氏鹽藻可能經(jīng)過這兩個途徑將八氫番茄紅素C20的前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)合成異戊烯焦磷酸(IPP)，再經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)最終合成類胡蘿卜素[5～7]。對一些高等植物和藻類的研究顯示，番茄紅素環(huán)化是類胡蘿卜素生物合成途徑的一個重要環(huán)節(jié)。番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase，LYCB)和番茄紅素ε-環(huán)化酶(lycopene ε-cyclase，LYCE)均可催化番茄紅素環(huán)化反應(yīng)。LYCE催化番茄紅素分子產(chǎn)生 δ-胡蘿卜素(δ-carotene)，再經(jīng)過LYCB的催化，δ-胡蘿卜素生成α-胡蘿卜素(α-carotene)。在合成β-胡蘿卜素時，LYCB先連續(xù)2次催化番茄紅素成為γ-胡蘿卜素，然后再生成β-胡蘿卜素。

抗艷紅等[8]以番茄(東農(nóng)704、東農(nóng)709、東農(nóng)906、利生一號)4個品種的下胚軸和子葉為受體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LYCE基因轉(zhuǎn)入番茄中并獲得了完整的抗性植株，經(jīng)PCR和PCR- Southern分析鑒定,初步證明外源基因LYCE已整合到番茄的基因組中。有研究表明，在鹽脅迫條件下雨生紅球藻(HaematococcusPluvialis)細(xì)胞α-胡蘿卜素含量顯著升高，表明雨生紅球藻含有較強(qiáng)活性的HpLCYE；進(jìn)一步通過分析HpLCYE和HpLCYB之間的競爭和協(xié)作控制代謝通量等表征，揭示了HpLCYE與HpLCYB的獨(dú)特環(huán)化順序，以及用于雜環(huán)類胡蘿卜素的生物合成的可能性[9]。目前，多數(shù)藻類LYCE序列是通過序列比對及基因組分析獲得的，僅對包括小球藻[10](Chromochloris)在內(nèi)的少數(shù)LCYE酶功能進(jìn)行了研究，多數(shù)藻類LCYE的功能及作用機(jī)制還鮮為人知。我們前期初步探討了LYCB在杜氏鹽藻β-胡蘿卜素合成和積累的作用[11]，還不清楚LYCE是否與LYCB競爭底物或協(xié)調(diào)相關(guān)代謝通量而影響杜氏鹽藻β-胡蘿卜素富集。

本研究以從運(yùn)城鹽湖分離的一株杜氏鹽藻(YC-Ds011)為試材，采用RT-PCR分離杜氏鹽藻DsLYCE基因cDNA克隆，構(gòu)建植物組成型表達(dá)載體pCAMBIA1303-DsLYCE，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株；通過煙草瞬時表達(dá)DsLYCE，研究DsLYCE功能以及異源表達(dá)對高等植物類胡蘿卜素合成及相關(guān)生理生化表征的影響。本研究將為全面解析DsLYCE功能及其應(yīng)用于高等植物類胡蘿卜素合成等代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源所提供，將其播種于土壤中，放置在25 ℃，12 h·d-1光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)60 d后用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達(dá)。

1.2 菌株、質(zhì)粒及試劑

農(nóng)桿菌GV3101、pCAMBIA1303質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源所保存。限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI、DNA Ladder Marker 購自生工生物工程有限公司; 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Trizol購自天根生物公司；PCR引物由安徽通用生物公司合成; 中量質(zhì)粒提取試劑盒、5X All-In-One MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于 ABM 公司。

1.3 杜氏鹽藻總RNA的提取

取DM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)13天杜氏鹽藻，離心收集處于對數(shù)生長期的藻細(xì)胞(約108數(shù)量級)，按照Trizol法提取鹽藻總RNA。-80 ℃保存，備用。

1.4 杜氏鹽藻LYCE基因的擴(kuò)增

參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用方法進(jìn)行操作。用經(jīng)過濃度和純度測定后的總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)條件：25 ℃，10 min；42 ℃，15 min；85 ℃，5 min。依據(jù)實驗室前期獲得的DsLYCE基因轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計擴(kuò)增全長ORF的引物L(fēng)YCE-F：5’-ATGAATTCCCTTCACAGTGGGTGCTGCAGC-3’和LYCE-R:5’-CACAAGAGGAGAAGGAGGTTTCGCAGCTG TGA-3’。高保真RT-PCR 反應(yīng)采用Pfu DNA Polymerase 酶，反應(yīng)體系參照說明書。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，58 ℃退火30 s, 68 ℃延伸2 min 30 s，30 次循環(huán)，68 ℃ 保溫 15 min，16 ℃ 15 min。將所有擴(kuò)增片斷純化回收后連接到PMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5-α中，篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA送通用生物公司(安徽)測序。

1.5 構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1303+DsLYCE

以攜帶DsLYCEORF 的PMD18-T克隆載體為模板，進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段。利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ對PCR純化產(chǎn)物及pCAMBIA1303質(zhì)粒進(jìn)行酶切，用T4 DNA連接酶將目標(biāo)片段連接于pCAMBIA1303載體的MCS。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)繁并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證。植物表達(dá)載體pCAMBIA1303-LYCE的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1303-DsLYCE結(jié)構(gòu)示意圖

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)分析

用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，利用熱激法將構(gòu)建好的超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。平板培養(yǎng)，挑選單菌落進(jìn)行檢測后，在含有Rif和Kan的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)至OD600為0.6，用于煙草瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)化。配置含有乙酰丁香酮、MgSO4、MES的重懸液100 mL，重懸菌體濃度至OD600為0.2。室溫放置4 h后，用注射器將農(nóng)桿菌重懸液接種于煙草葉表面。接種后室溫生長3 d后，提取葉片RNA。

1.7 煙草瞬時表達(dá)葉片GUS染色

取接種3 d后的煙草葉片進(jìn)行GUS染色，將煙草葉片浸入X-GUS染液中，染色方法參照GUS染色試劑盒。

1.8 煙草瞬時表達(dá)的PCR檢測

取煙草葉片利用液氮充分研磨，Trizol Reagent 提取總RNA，具體方法參照說明書。以RNA為模板，cDNA合成反應(yīng)體系參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min；42 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min。以獲得cDNA為模板，用目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%凝膠電泳檢測。

1.9 煙草葉片色素提取及測定

取煙草葉片利用液氮研磨，加入80%的丙酮進(jìn)行處理，定容至50 mL。4 ℃避光保存24 h至樣品顏色發(fā)白，利用紫外分光光度計進(jìn)行比色測定。轉(zhuǎn)pCAMBIA1303空載煙草和未侵染的野生型煙草作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻LYCE基因cDNA克隆

對源于杜氏鹽藻藻株Ds-YC011藻細(xì)胞cDNA進(jìn)行高保真RT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離結(jié)果(圖2)顯示，RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出一條長度約為1 700 bp的目標(biāo)條帶。經(jīng)測序獲得1 686 bp的核苷酸序列。編碼區(qū)序列與實驗室中所獲得杜氏鹽藻LYCE基因序列比對結(jié)果表明，從Ds-YC011鹽藻株系擴(kuò)增的DsLYCEcDNA克隆與杜氏鹽藻LYCE基因DNA序列有6%的差異，但推測的氨基酸序列無差異。這表明分離獲得了正確的DsLYCEcDNA克隆。

M為Marker；A、B為DsLYCE cDNA

2.2 pCAMBIA1303-DsLYCE表達(dá)載體的雙酶切鑒定

經(jīng)XbaⅠ和KpnⅠ對重組表達(dá)載體pCAMBIA1303-DsLYCE的酶切結(jié)果如圖3所示，其中LYCE片段的大小約1 700 bp。

M:12 000 bp DNA Marker; A.XbaⅠ、KpnⅠ酶切pCAMBIA1303-DsLYCE質(zhì)粒; B.pCAMBIA1303質(zhì)粒

2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化檢測結(jié)果

利用熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，挑單菌落，進(jìn)行菌液PCR檢測。檢測結(jié)果如圖4所示，在1 700 bp處有目的條帶，表明目的基因DsLYCE成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，保存并用于后續(xù)實驗。

M:2 000 bp DNA Marker;泳道1、2、3、4、5為DsLYCE擴(kuò)增片段

2.4 煙草葉片GUS染色

將野生型煙草葉片和DsLYCE瞬時表達(dá)的葉片在X-Gluc溶液中浸泡后鏡檢。如圖5所示，A圖為野生型煙草的GUS染色鏡檢結(jié)果，沒有細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。B圖為瞬時表達(dá)的煙草葉片GUS染色鏡檢結(jié)果，在視野中可以觀察到細(xì)胞被染成藍(lán)色，可見綠色熒光蛋白的表達(dá)與對照相比有明顯差異。因此可以判斷DsLYCE基因在煙草下表皮細(xì)胞中成功表達(dá)。

A野生型煙草;B 瞬時表達(dá)煙草

2.5 煙草瞬時表達(dá)PCR檢測結(jié)果

提取各樣品煙草葉片總RNA，并經(jīng)核酸濃度儀測定其濃度及OD260/280值，OD260/280均在1.8～2.0之間，可用作后期cDNA合成和PCR檢測DsLYCE基因表達(dá)。如圖6所示，DsLYCE在煙草葉中有效表達(dá)。

M:2 000 bp DNA Marker;泳道1、2、3、4為DsLYCE擴(kuò)增片段

2.6 DsLYCE瞬時表達(dá)對煙草葉片類胡蘿卜素及葉綠素含量的影響

煙草葉片色素含量測定如圖7所示，轉(zhuǎn)入pCAMBIA1303空載煙草與野生型煙草葉片的類胡蘿卜素、葉綠素a與葉綠素b的含量均沒有明顯的差異。轉(zhuǎn)DsLYCE基因的煙草葉片中類胡蘿卜素比野生型增加24%，類胡蘿卜素含量差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。葉綠素a和葉綠素b含量較野生煙草及轉(zhuǎn)空載的煙草葉片中的含量也顯著提高。這說明DsLYCE能在異源煙草葉組織中行使催化功能，促進(jìn)類胡蘿卜素合成積累，同時還能提高葉綠素含量，有利于光合作用。

圖中小寫字母表示處理間存在顯著性差異P<0.05

3 討論

在植物類胡蘿卜素合成途徑中，番茄紅素的環(huán)化是一個重要分支節(jié)點，番茄紅素β-環(huán)化酶(LYCB)與LYCE的共同作用產(chǎn)生α-胡蘿卜素。α-胡蘿卜素是橘黃色脂溶性化合物，是合成葉黃素的生物前體。但目前關(guān)于α-胡蘿卜素的合成機(jī)制研究甚少。在玉米中，已經(jīng)克隆并鑒定了LYCE基因，屬于單拷貝基因[12]。LYCE基因和LYCB基因共同表達(dá)的強(qiáng)弱,決定了α-胡蘿卜素在類胡蘿卜素中的比例[13]。有關(guān)研究表明：使用番茄紅素環(huán)化酶抑制劑可降低LYCE基因的轉(zhuǎn)錄水平，可增加番茄紅素的代謝量[14]。Halilu, Alhassan等人[15]利用分子標(biāo)記法對類胡蘿卜素生物合成過程中關(guān)鍵基因LYCE進(jìn)行分析，結(jié)果表明：LYCE基因有利于玉米胚乳中維生素原A活性類胡蘿卜素的增加。有關(guān)玉米天然類胡蘿卜素變異的研究表明，降低LYCE等位基因的表達(dá)，可以增加β胡蘿卜素的產(chǎn)量[12]。李群睿等[16]從自交系玉米B73克隆LYCE基因，并且發(fā)現(xiàn)該基因可在番茄紅素的2個末端添加2個ε-紫羅蘭酮環(huán)進(jìn)而生成ε-胡蘿卜素。江琳玉[17]成功地采用RT-PCR從中國水仙中克隆了LYCE基因。但是，目前關(guān)于LYCE基因在類胡蘿卜素復(fù)雜的合成代謝途徑中的具體分子機(jī)理研究，尤其是在微藻類胡蘿卜素合成代謝中的作用鮮見報道。

為了深入研究DsLYCE在杜氏鹽藻的類胡蘿卜素合成過程中的分子機(jī)理，本文成功克隆到DsLYCE基因的cDNA，同時構(gòu)建了pCAMBIA1303+DsLYCE植物表達(dá)載體，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草瞬時表達(dá)以鑒定其功能。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)DsLYCE基因煙草葉片中類胡蘿卜素比野生型增加24%，葉綠素a和葉綠素b含量也較野生型煙草及轉(zhuǎn)空載的煙草葉片中的含量顯著提高。這表明杜氏鹽藻DsLYCE基因可編碼具活性的酶蛋白，促進(jìn)異源宿主煙草葉片中類胡蘿卜素的合成與積累，以及提高葉綠素含量。葉綠素含量的提高可能是由于類胡蘿卜素含量顯著增加，保護(hù)葉綠素免受強(qiáng)光破壞，或者是由于DsLYCE過表達(dá)上調(diào)了葉綠素合成途徑，具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究證明所分離的杜氏鹽藻LYCE基因可編碼具有活性的酶蛋白，在異源植物組織中超表達(dá)不僅能顯著促進(jìn)類胡蘿卜素合成和積累，還有利于光合作用。這為解析包括微藻在內(nèi)的植物類胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)制及相關(guān)色素代謝的遺傳修飾提供了新知識和靶標(biāo)分子。