李鈺瑩，徐洪雨，馬宏，李正紅*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)院 資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224)

滇丁香屬(Luculia)植物是一類花型漂亮、花期長(zhǎng)和花香濃郁的木本花卉，具有開(kāi)發(fā)價(jià)值[1]。滇丁香屬植物在世界范圍內(nèi)主要分布于亞洲南部至東南部，在我國(guó)有3個(gè)種和1個(gè)變種，分布于廣西、云南和西藏地區(qū)。滇丁香(Luculiapinceana)在我國(guó)的分布范圍最廣，花色豐富、易人工栽培。與另一品種雞冠滇丁香(Luculiayunnanensis)相比，滇丁香的花朵略小。雞冠滇丁香花型豐富、花香馥郁，作為我國(guó)特有植物，僅分布在云南的怒江地區(qū)，其分布范圍窄、對(duì)生境要求高。

對(duì)于木本花卉，株型、花型和花香是影響其推廣的最重要的農(nóng)藝性狀。在滇丁香屬植物的推廣中，利用現(xiàn)有的滇丁香屬植物種植資源，培育花香馥郁、花型優(yōu)美和花色多變的新品種是首要工作。在園藝植物新品的培育工作中，雜交育種是一種能夠改善其農(nóng)藝性狀的重要技術(shù)手段[2～4]。單從滇丁香易于人工栽培的特點(diǎn)，它可以作為滇丁香屬植物推廣的首選品種。但本研究組在過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)，滇丁香花香成分中苯環(huán)類物質(zhì)的相對(duì)含量較高(51.61%以上)[5]，花香氣味不佳，影響推廣。雞冠滇丁香花香揮發(fā)物中萜類物質(zhì)相對(duì)含量較高(64.67%以上)[6]，與滇丁香花香成分差異大，兩者花香各具特色。為培育出香型新穎、馥郁的新品種，本研究組以采自云南省怒江州的雞冠滇丁香為父本(25°58′N，98°48′E)、人工栽培滇丁香為母本，在云南省楚雄州祿豐縣滇中高原試驗(yàn)站(25°13′N，102°12′E)進(jìn)行了雜交試驗(yàn)。本研究以滇丁香雜交一代F1(以下簡(jiǎn)稱雜交滇丁香)及其父母本為研究材料，采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)，對(duì)雜交滇丁香及其父母本的花香成分和花香釋放規(guī)律進(jìn)行測(cè)定，對(duì)比雜交滇丁香與父母本花香成分的差異，討論雜交滇丁香的花香成分與父母本的關(guān)系，旨在為未來(lái)雜交滇丁香屬植物的花香育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及取樣

植物來(lái)源：花香檢測(cè)所用的父本雞冠滇丁香花序樣品采自云南省怒江州(25°58′N，98°48′E)，滇丁香和雜交滇丁香的花序采自祿豐試驗(yàn)站。取樣時(shí)，每種滇丁香屬植物選擇3株，每株選擇3個(gè)完整花序。所取的花序樣品瓶插(蒸餾水)后帶回實(shí)驗(yàn)室(云南省昆明市資源昆蟲研究所)，所有花序樣品在瓶插3 d后進(jìn)行花香成分的測(cè)定。

樣品的采集：在開(kāi)花時(shí)節(jié)，按花朵發(fā)育進(jìn)程花蕾期(Ⅰ)、初花期(Ⅱ)、盛花期(Ⅲ)和衰花期(Ⅳ)4個(gè)時(shí)期分別對(duì)3種滇丁香屬植物的花香成分進(jìn)行檢驗(yàn)。檢測(cè)時(shí)，每個(gè)花期階段從每個(gè)花序中選1朵花進(jìn)行花香測(cè)定，即每個(gè)處理共測(cè)9個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

花香的測(cè)定使用HP-SPME頂空-固相微萃取全自動(dòng)進(jìn)樣臺(tái)(Thermo Fisher Scientic, USA)和TRACE GC Ultra/ITQ900氣質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher Scientic, USA)。萃取頭為PDMS 100 μm(Supelco，USA)，色譜柱為DB-5MS(Agilent J&W scientific, USA)。

1.3 試驗(yàn)方法

花香的收集采用頂空固相微萃取法。取大小一致的花朵，除去花柄后放入15 mL透明玻璃樣品瓶。然后，向瓶中插入萃取頭，25 ℃條件下頂空吸附40 min。

GC/MS分析時(shí)，色譜條件：進(jìn)樣口溫度設(shè)置為250 ℃；升溫程式為起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以6 ℃·min-1的速度將溫度升高到130 ℃，再以15 ℃·min-1的速度升高到280 ℃，保持5 min;質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV，全掃描模式，傳輸線溫度200 ℃，掃描質(zhì)量范圍為50～650 amu。

在保留指數(shù)的計(jì)算中，色譜純?yōu)镃6～C19正構(gòu)烷烴(Supelco，USA)，樣品進(jìn)樣量為0.1 μL。按上述條件進(jìn)行GC/MS分析時(shí)，記錄下14個(gè)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，然后再根據(jù)線性升溫公式計(jì)算出各花香成分的保留指數(shù)(linear retention index，LRI)。

式中，LRI為保留指數(shù)；tx為待測(cè)組分的保留時(shí)間/min；tn為具有n個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；tn+1為具有n+1個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在對(duì)所測(cè)定的花香成分進(jìn)行定性分析時(shí)，使用TF Xcalibur 2.1.0軟件對(duì)揮發(fā)性化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，參考標(biāo)準(zhǔn)圖片數(shù)據(jù)庫(kù)(National Institute of Standards and Technology，NIST08)進(jìn)行檢索，檢索后人工輔助對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，并參考科學(xué)文獻(xiàn)中各揮發(fā)物成分的保留指數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

對(duì)花香揮發(fā)物成分進(jìn)行相對(duì)定量分析時(shí)，采用面積歸一化法分析質(zhì)譜圖，從而求得各組分的相對(duì)含量。各花香成分相對(duì)含量的計(jì)算公式如下：

使用PC-ORD5.0軟件(MjM Software, Gleneden Beach, OR, USA)，根據(jù)各揮發(fā)物峰面積大小進(jìn)行主成分分析(PCA)和Bray-Curtis相似性(BCS)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 父本雞冠滇丁香花香的揮發(fā)物成分

父本雞冠滇丁香的花香成分中共包含40種物質(zhì)(附表1)。據(jù)表1可知，在花蕾期、初花期和衰花期中，萜類物質(zhì)的相對(duì)含量均超過(guò)90%，而在盛花期中萜類物質(zhì)占比86.24%。由此可見(jiàn)，雞冠滇丁香的花香的主要成分為萜類物質(zhì)。從花蕾期到初花期和盛花期，苯環(huán)類化合物相對(duì)釋放量逐漸升高，并在盛花期達(dá)到最高，為12.90%。從花蕾期到衰花期，脂肪族化合物的相對(duì)含量在初花期和盛花期有所降低，而到衰花期時(shí)，脂肪族化合物的相對(duì)含量再次升高至初花期時(shí)的大小。

在4個(gè)花期階段的花香成分中，相對(duì)含量較大的物質(zhì)有3-Carene、α-Cubebene、α-Copaene、Isoledene、δ-Cadinene和Cadine-1,4-diene，這幾種物質(zhì)均為萜類。與本研究的另外兩種滇丁香(雜交滇丁香和滇丁香)相比，雞冠滇丁香的花香成分中丹皮酚(Paeonol)的相對(duì)含量較少，且僅在盛花期中檢測(cè)到了此物質(zhì)，相對(duì)含量占比12.73%。

注：同列不同小寫字母表示該類化合物不同階段間差異顯著(P<0.05)

Note: Letters in each column mean significant difference in one substance among the four stages(P<0.05)

2.2 母本滇丁香花香的揮發(fā)物成分

母本滇丁香的花香成分中共包含39種物質(zhì)(附表2)。據(jù)表2可見(jiàn)，滇丁香花香的主要成分為苯環(huán)類化合物和萜類。在4個(gè)花期階段中，苯環(huán)類化合物和萜類的共占比達(dá)到97%以上。在花蕾期，萜類和苯環(huán)類化合物的相對(duì)含量相差較小，均約為50%。在初花期，苯環(huán)類化合物的相對(duì)含量快速升高，達(dá)到85.88%。在盛花期和衰花期，苯環(huán)類化合物的相對(duì)含量有所降低，但其相對(duì)相對(duì)含量仍在75%以上，萜類的相對(duì)含量有所提高。初花期和盛花期為滇丁香賞花的關(guān)鍵時(shí)期，而在這兩個(gè)時(shí)期，滇丁香花香揮發(fā)物組分中苯環(huán)類化合物的相對(duì)含量均超過(guò)80%。

表2 母本滇丁香花香中各揮發(fā)物組分所占的比例

注：同列不同小寫字母表示該類化合物不同階段間差異顯著(P<0.05)

Note: Letters in each column mean significant difference in one substance among the four stages(P<0.05)

在滇丁香的花香成分中，丹皮酚的相對(duì)含量最高，在4個(gè)時(shí)期其相對(duì)含量分別占比51.58%、83.03%、79.72%和69.75%。除丹皮酚外，相對(duì)含量較大的物質(zhì)還有(E, E)-α-Farnesene(萜類)、Cyclosativene(萜類)、Isoledene(萜類)、Cubedol(萜類)和δ-Cadinene(萜類)。

2.3 雜交滇丁香花香的揮發(fā)物成分

雜交滇丁香的花香成分共包含50種物質(zhì)(附表3)。據(jù)表3可知，雜交滇丁香花香的主要成分為苯環(huán)類化合物，其中主要物質(zhì)為丹皮酚。在4個(gè)花期階段中，丹皮酚所占的相對(duì)含量均在90%以上，具體分別為92.09%、93.86%、91.56%和90.42%。在雜交滇丁香的花香成分中，萜類物質(zhì)的相對(duì)含量較少，其在4個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，在盛花期達(dá)到最大，為5.99%。

表3 雜交滇丁香花香中各揮發(fā)物組分所占的比例

注：同列不同小寫字母表示該類化合物不同階段間差異顯著(P<0.05)

Note: Letters in each column mean significant difference in one substance among the four stages(P<0.05)

2.4 雜交滇丁香花香與父母本的異同

經(jīng)過(guò)對(duì)3種滇丁香屬植物花香組分的分析發(fā)現(xiàn)，雜交滇丁香花香組分中特有的物質(zhì)共有15種，具體分別為1,3,5-Cycloheptatriene；1,6-Heptadien-3-yne；2′,4′-Dihydroxy-3′-methylacetophenone；Benzene, hexyl-；Retinal；2,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-(1-oxopropyl)phenol；Acetic acid, 2-phenylethyl ester；Benzene ethanamine, a-methyl-；Benzene ethanamine, N-methyl-；Benzene, 1,3-dimethyl-；Dibutyl phthalate；Formic acid, 2-phenylethyl ester；Isolongifolol；Isoretinene A；α-Farnesene。在4個(gè)花期階段，這些特有物質(zhì)占花香釋放量的比例在1.59%～6.19%之間。

父本雞冠滇丁香花香組分中特有的物質(zhì)共有10種，具體分別為(-)-Aristolene；6,7-Dimethyl-1,2,3,5,8,8a -hexahydronaphthalene；Benzene, 1,2,3-trimethoxy-5-(2-propenyl)-；cis-Muurola-3,5-diene；Humulene；Isopropyl myristate；Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a -hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-；Phenylethyl alcohol；Propanoic acid, 2-methyl-, 2-ethyl-3-hydroxyhexyl ester；α-Guaiene。在4個(gè)花期階段中，這些特有物質(zhì)占雞冠滇丁香花香總釋放量的比例在8.29%～16.71%之間。

母本滇丁香花香組分中特有的物質(zhì)共有8種，具體分別為(3E,5Z)-1,3,5-Undecatriene；(E)-β-Ocimene；(Z)-Verbenol；Cyclosativene；Nonanoic acid,ethyl ester；Pentanoic acid, 2,2,4-trimethyl-3-carboxyisopropyl, isobutyl ester；Perilla alcohol；Phenol,2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-(1-methylpropyl)。在4個(gè)花期階段中，這些特有的揮發(fā)性物質(zhì)占滇丁香花香總釋放量的比例在1.21%～6.21%。

為分析雜交滇丁香花香成分及相對(duì)含量與父母本之間的異同，本研究采用主成分分析法對(duì)3種滇丁香屬植物在4個(gè)時(shí)期的花香揮發(fā)性物(包括物質(zhì)成分和相對(duì)含量)進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，通過(guò)主成分分析的降冪處理，雜交滇丁香、滇丁香和雞冠滇丁香分處在不同的象限中，主成分分析法能夠有效地將雜交滇丁香與父母本的花香成分區(qū)分開(kāi)，花香的揮發(fā)物組成及相對(duì)含量在三者之間差異的很大。

為進(jìn)一步分析雜交滇丁香與父母本在4個(gè)時(shí)期的花香揮發(fā)性物(包括成分及相對(duì)含量)的異同，進(jìn)一步采用Bray-Curtis相似性分析法對(duì)其進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知，在4個(gè)時(shí)期，滇丁香與雞冠滇丁香的花香(包括成分和相對(duì)含量)差異較大，兩者相似度在7.35～51.55之間。此外，滇丁香僅在花蕾期與雞冠滇丁香的相似度較高，約30%～50%。

在子一代雜交滇丁香與父母本花香(成分及相對(duì)含量)相似度的比較中，雜交滇丁香與父本雞冠滇丁香的相似度較低，除雞冠滇丁香在盛花期與雜交滇丁香的相似度能夠達(dá)到10%～20%外，在其余階段的相似度均低于5%。而在雜交滇丁香與母本滇丁香花香的比較中，除滇丁香在花蕾期與雜交滇丁香的相似度在52%～56%外，在其余階段的相似度均在70%以上。

綜上所述，父本雞冠滇丁香與母本滇丁香和子一代雜交滇丁香花香成分的相似度均不高，而子一代雜交滇丁香與母本滇丁香花香成分的相似度卻極高。

表4 雜交滇丁香與父母本花香成分的相似度

注：(I)花蕾期；(II)初花期；(III)盛花期；(IV)衰花期

Note:(I)Bud stage;(II)Initial-flowering stage;(III)Full-flowering stage; and(IV)End-flowering stage

Ⅰ: 花蕾期; Ⅱ: 初花期; Ⅲ: 盛花期; Ⅳ: 衰花期

2.5 雜交滇丁香花香釋放量在時(shí)間上的變化

圖2為雜交滇丁香及其父母本花香成分測(cè)定時(shí)的總離子色譜圖。由圖2可見(jiàn)，滇丁香屬植物花部揮發(fā)物的釋放量隨花部發(fā)育的進(jìn)程呈規(guī)律性變化。雜交滇丁香同父母本一致，在4個(gè)開(kāi)花階段，花香的釋放量均呈單峰模式。具體釋放模式為：花香的釋放量在初花期達(dá)到最大，而在盛花期和衰花期呈逐漸下降趨勢(shì)。

在4個(gè)開(kāi)花階段，父本雞冠滇丁香和母本滇丁香在每一階段釋放的花香均是多峰的，由此說(shuō)明二者的花香成分比較復(fù)雜。而雜交滇丁香在每一開(kāi)花階段花香的釋放均是單峰的，其原因是由于雜交滇丁香花香的主要成分為丹皮酚，在4個(gè)階段，花香組分中丹皮酚的相對(duì)含量均達(dá)到90%以上。

Ⅰ: 花蕾期; Ⅱ: 初花期; Ⅲ: 盛花期; Ⅳ: 衰花期

3 討論

本研究不僅分析了雜交滇丁香花香的成分，還對(duì)雜交滇丁香與父母本花香成分的異同進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹皮酚這一苯環(huán)類物質(zhì)是雜交滇丁香和母本滇丁香花香的主要成分，而父本雞冠滇丁香的花香主要成分卻為萜類物質(zhì)。與滇丁香屬的其它植物相比，馥郁滇丁香(Luculiagratissima)花香揮發(fā)物的主要成分是倍半萜類物質(zhì)[7]。而在同為茜草科的Posoqueria屬中，Posoquerialatifolia花香揮發(fā)物主要成分也為倍半萜類[8]，但風(fēng)箱樹(shù)屬Cephalanthusoccidentalis[9]、猩猩木屬Warszewicziacoccinea[9]和梔子花屬Gardeniajasminoides[10]植物花香揮發(fā)物的主要成分是單萜類，咖啡樹(shù)屬CoffeaArabica[11]植物花香揮發(fā)物的主要成分則為脂肪烴類。由此可見(jiàn)，雖是同科植物，花香揮發(fā)物的主要成分并無(wú)規(guī)律可循。前人的研究還發(fā)現(xiàn)，花香揮發(fā)物的主要成分即便是在近源物種之間也會(huì)有較大差異[12]，滇丁香屬植物亦是如此。

雞冠滇丁香和滇丁香分別作為雜交滇丁香的父本和母本，雞冠滇丁香花香揮發(fā)物的主要成分是萜類物質(zhì)，滇丁香花香的揮發(fā)物主要成分是萜類和苯環(huán)類，而雜交滇丁香花香揮發(fā)物的主要成分是苯環(huán)類，與滇丁香的花香成分更為接近。Hiroshi等曾用亞細(xì)胞定位的方法，確定出苯丙素類物質(zhì)合成的莽草酸途徑中所涉及到的酶均存在于質(zhì)體[13]。在被子植物農(nóng)藝性狀的遺傳中，共有單親母系質(zhì)體遺傳、單親父系質(zhì)體遺傳和雙親質(zhì)體遺傳3種類型[14]，其中單親母系質(zhì)體遺傳占比較大，僅有很少數(shù)植物采用雙親質(zhì)體遺傳和單親父系質(zhì)體遺傳，如紫茉莉科紫茉莉Mirabilisjalapa[15]、杜鵑花科迎紅杜鵑Rhododendronmucronulatum[16]、牻牛兒苗科天竺葵屬植物Pelargoniumspp.[17]等屬于雙親質(zhì)體遺傳，豆科紫苜蓿Medicagosativa[18]、十字花科胡蘿卜屬植物Daucusspp.[19]、旋花科牽牛屬植物Pharbitisspp.[20]等屬于單親父系遺傳。但是，在滇丁香屬植物乃至茜草科中均未能查到關(guān)于質(zhì)體遺傳方面的研究。假設(shè)滇丁香屬植物屬于單親母系質(zhì)體遺傳，那么雜交滇丁香花香揮發(fā)物中苯環(huán)類物質(zhì)的含量較高就不難解釋了。以滇丁香為母本，通過(guò)母系質(zhì)體遺傳，雜交滇丁香因此繼承了母本滇丁香編碼合成苯環(huán)類物質(zhì)的酶的基因。

萜類物質(zhì)蒈烯(3-Carene)具有檸檬和松脂的香味，α-蓽澄茄油烯(α-Cubebene)具有青草香，α-胡椒烯(α-Copaene)具有木材和香料的香味，杜松烯(δ-Cadinene)具有百里香和木材的香味，而雞冠滇丁香花香的主要成分就是這些萜類，并且其含量都在90%以上。雖然滇丁香的花香成分中含有一定比例的萜類，但是苯環(huán)類物質(zhì)的相對(duì)含量卻要高很多。而對(duì)于雜交滇丁香，在本研究的4個(gè)時(shí)期，苯環(huán)類物質(zhì)的相對(duì)含量均在90%以上。苯環(huán)類物質(zhì)，尤其是丹皮酚，它是具有特殊氣味的物質(zhì)，不能令人產(chǎn)生愉悅感。由此可見(jiàn)，在對(duì)滇丁香屬植物中進(jìn)行育種時(shí)，若以花香育種為目標(biāo)，以雞冠滇丁香作為母本，或許是一條避免雜交滇丁香花香中丹皮酚含量過(guò)高的途徑。

本研究中滇丁香、雞冠滇丁香和雜交滇丁香花香大量釋放的時(shí)間均是在初花期。在過(guò)去對(duì)植物花香釋放規(guī)律的研究中，有些植物花香大量釋放的時(shí)間是在盛花期，如檸檬羅勒(Ocimumcitriodorum)[21]和玉簪(Hostaventricosa、H.‘Moonlight Sonata’和H.plantaginea)[22]；有些植物則是在花蕾期，如紅眼金合歡(Acaciacyclops)[23]；還有些植物是在初花期，如“波葉金桂”(Osmanthusfragrans‘Boye Jingui')[24]。因此，不同的植物，其花香揮發(fā)物組分與釋放規(guī)律不盡相同，可能是與吸引不同習(xí)性的傳粉昆蟲有關(guān)[25]。

4 結(jié)論

滇丁香屬植物花香的主要成分為萜類和苯環(huán)類化合物。在雜交滇丁香和母本滇丁香的花香成分中，苯環(huán)類的丹皮酚相對(duì)含量最高。父本雞冠滇丁香花香成分中，萜類物質(zhì)的相對(duì)含量最高，苯環(huán)類化合物(包括丹皮酚)的相對(duì)含量很少。與父本相比，雜交滇丁香的花香成分與母本滇丁香的相似度更高。雜交滇丁香花香釋放的最大量出現(xiàn)在初花期，花香釋放呈先升高后降低的單峰模型，與父母本保持一致。雜交滇丁香在每一開(kāi)花階段花香的釋放均為單峰，與其花香成分中僅丹皮酚的相對(duì)含量就占比90%以上有關(guān)。