張旭，程遠方，張江霞，宋沛然，張靜

胰腺癌是世界范圍內(nèi)致死率較高的重度惡性消化系統(tǒng)癌癥，病人多早期癥狀較為隱匿，疾病確診時多已處于中晚期，多治療效果不佳，5年生存率不及5%［1］。吉西他濱（Gemcitabin，GEM）是中晚期胰腺癌化療的標(biāo)準(zhǔn)用藥，但隨著化療期延長而逐步耐藥，并具有一定的毒副作用，吉西他濱聯(lián)用卡培他濱、奧沙利鉑、5-FU 順鉑等雖能一定程度改善治療效果，但療效仍不理想［2-3］。因此，尋找一種能夠降低胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥并提升其抑瘤效果的藥物意義重大。在化療過程中，多藥耐藥基因（multidrug resistance gene-1，MDR-1）是導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥和化療失敗的主要因素，MDR-1 編碼的P 糖蛋白（P-gp）過表達而導(dǎo)致胰腺癌病人對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥［4］。同時，腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移與上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（cpithclial-mcscnchymal，EMT）有著顯著相關(guān)性。大黃素本質(zhì)為蒽醌類提取物，十多張抗腫瘤重要的有效活性成分，多項研究表明其能抑制腫瘤發(fā)展，促進腫瘤生長和凋亡［5］。本研究自2018年3月至2019年3月探究吉西他濱聯(lián)合大黃素對胰腺癌SW1990 細胞增殖與侵襲的影響，并嘗試初步分析聯(lián)合應(yīng)用增強胰腺癌治療效果的可能機制。

1 資料與方法

1.1 細胞系與細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株SW1990由美國組織培養(yǎng)庫（ATCC）提供。均培養(yǎng)于含100μg/mL 鏈霉素、100U/mL 青霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層貼壁生長融合70%～80%，胰蛋白酶消化傳代。

1.2 藥品、試劑和儀器 藥品與試劑：胎牛血清、RPMI1640 及胰酶購自美國Gibco 公司；大黃素（emodin），購自美國Sigma 公司，用DMSO 配制成0.2 mol/L，終濃度＜0.1%；吉西他濱購自法國禮來公司；Trizol 和MTT 試劑購自美國Sigma 公司；兔抗人Bcl-2 多克隆抗體及鼠抗人Bax 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；Caspase-3及Survivin 兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；TWIST1、ZEB1、E-cadhcrin、β-actin 單克隆抗體購自美國CST 公司；Transwell 小室模型購自美國康寧公司；RT-PCR 試劑盒由中國吉麻制藥技術(shù)有限公司提供。

儀器：Bio-Plex200 流式細胞儀及1658001 蛋白印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司，RD-PCR儀由西安天空科技有限公司提供，HH-CP-01W 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱由上海蘭儀實業(yè)有限公司提供。

1.3 細胞分組與處理 將處于生長對數(shù)期的SW1990 細胞分為大黃素組、吉西他濱組、大黃素聯(lián)合吉西他濱組及對照組，大黃素組給予40μmol/L 大黃素處理SW1990/Gem 細胞，吉西他濱組給予20 μmol/L 吉西他濱處理SW1990/Gem 細胞，聯(lián)合組給予與前等量大黃素和吉西他濱聯(lián)合處理SW1990/Gem 細胞，對照組給予等量0.1%DMSO溶液。

1.4 流式細胞儀檢測 （1）流式細胞儀檢測細胞凋亡。96孔板每孔接種4×103的細胞過夜培養(yǎng)，細胞按照1.3分組處理48 h后，采用胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS沖洗2次，加入Binging Buffer重懸細胞，加入5μL PI 和5μL Annexin V-FITC，室溫避光15 min，于激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm 上機檢測，重復(fù)3次，采用Cell quest軟件分析。

（2）流式細胞儀檢測細胞膜糖蛋白（P-gp）陽性率。收集各組胰腺癌細胞調(diào)至1×107/mL備用，臺盼藍染色計數(shù)（＞90%～95%），加入工作濃度（1∶50）PE標(biāo)記熒光素抗體，以陰性SW1990 胰腺癌細胞做對照，室溫孵育20 min，PBS沖洗2次，1 500 r/min離心3 min 棄去上清，PBS 沖洗2 次，加入300 mL PBS 重懸細胞，上機檢測陽性率。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖 96 孔板每孔接種4×103的細胞過夜培養(yǎng)，細胞按照1.3分組處理48 h后，棄去上清，加入5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO 后震蕩10 min，實驗重復(fù)3 次，每組6 個重復(fù)，測定每孔光密度，計算細胞存活率。

1.6 Transwell 小室模型檢測胰腺癌細胞侵襲能力 收集各組胰腺癌細胞調(diào)至1×105/mL 備用。將60 mg 于4 ℃冷藏過夜的Matrigel 膠取出放置在冰上，與無血清培養(yǎng)基混勻稀釋，取60μL混合液加入Transwell 小室，于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2 h，將200μL 預(yù)先備好的胰腺癌細胞懸液均勻加入Transwell小室底部膜上室面，下室面加入600μL的10%胎牛血清培養(yǎng)基，于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出上室，棄去液體，4%多聚甲醛固定15～20 min，0.1%結(jié)晶紫染色40 min，PBS 沖洗靜置干燥，×100顯微鏡下觀察胰腺癌細胞穿透數(shù)量。

1.7 qRT-PCR 檢測MDR-1、miRNA-1271及EMT相關(guān)標(biāo)志物（TWIST1、ZEB1、E-cadhcrin）mRNA表達 （1）收集各組胰腺癌細胞，采用Trizol 試劑提取細胞總RNA，以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。反應(yīng)體系：RNA 樣本1μL，dNTPs（10 mmol/L）0.8μL，RT primers（1 μmol/L）1.3 μL，5×RT buffer 4 μL，MMLV Reverse TranscriptASC 0.3 μL，總 反 應(yīng) 體 系20 μL，16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃10 min。

（2）RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.33μL，無核酸酶水7.67μL、引物及探針混合物1.0μL、2×通用混合物10 μL，U6 及β-actin 基因作為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40個循環(huán)。

MDR-1 引物，正向：5′-GAATCTGGAGGAACACATGACC - 3′ ，反 向：5′ TCCAATTTTGTCACCAATTCC3′。

miRNA-1271 引 物，正 向：5′-CAGCACTTGGCACCTAGCA - 3′ ；反 向：5′ - TATGGTTGTTCTCCTCTCTGTCTC-3’。

TWIST1 引 物，正 向：5′ - AGCTGAGCAAGATTCAGACCCTCA-3′，反向：5′-CTGCAGCTTGCCATCTTGGAGT-3′。

ZEB1 引 物，正 向：5′ -GCACAACCAAGTGCAGAAGA-3′ ，反 向：5′ -CATTTGCAGATTGAGGCTG-3′。

E-cadhcrin 引物，正向：5′-AAGTGCTGCAGCCAAAGACAGA-3′，反向：5′-AGGTAGACCCACCTCAATCATCCTC-3′。

MDR-1、miRNA-1271、TWIST1、ZEB1及E-cadhcrin 相對表達量采用2-△△Ct計算，△△Ct＝（待測組目的基因平均Ct 值-待測組內(nèi)參基因平均Ct 值）-（對照組目的基因平均Ct 值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值）。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達 收集各組胰腺癌細胞常規(guī)方法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加入含5%脫脂奶粉Tris 緩沖液封閉2 h，加入Caspase-3、Survivin、TWIST1、ZEB1、E-cadhcrin 抗體孵育過夜，加入二抗孵育2 h，ECL 發(fā)光液顯色。采用Bandscan 5.0 分析條帶灰度值，并計算蛋白的相對表達量。目的蛋白相對表達量＝目的條帶灰度值/樣本內(nèi)參灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。觀測資料主要為計量資料，多組間比較采用單因素方差分析+兩兩比較LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素與吉西他濱單獨及聯(lián)合作用對胰腺癌SW1990 細胞凋亡、增殖及侵襲的影響 聯(lián)合組可顯著抑制胰腺癌SW1990 細胞增殖和侵襲，SW1990細胞凋亡率顯著更高，與其他三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組胰腺癌SW1990細胞凋亡、增殖及侵襲能力比較/

表1 各組胰腺癌SW1990細胞凋亡、增殖及侵襲能力比較/

注：與對照組比較，aP＜0.05；與聯(lián)合組比較，bP＜0.05

組別對照組大黃素組吉西他濱聯(lián)合組F值P值細胞侵襲/個244.4±9.1 175.3±9.5ab 192.0±8.6ab 105.8±7.8a 13.141 0.000細胞凋亡/%2.2±1.5 8.3±2.4ab 10.1±3.0ab 26.9±3.7a 14.622 0.000細胞增殖/%100.0±3.0 80.5±2.8ab 77.6±3.1ab 60.1±2.4a 9.850 0.000

2.2 RT-PCR 檢測MDR-1、miRNA-1271 及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達 聯(lián)合組MDR-1 mRNA顯著降低，miRNA-1271 及E-cadhcrin mRNA 顯著升高，且與其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各組TWIST1、ZEB1 mRNA 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組MDR-1、miRNA-1271及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達RT-PCR檢測結(jié)果

表2 各組MDR-1、miRNA-1271及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達RT-PCR檢測結(jié)果

注：與對照組比較，aP＜0.05；與聯(lián)合組比較，bP＜0.05，MDR-1為多耐藥基因-1，miRNA-1271為微小RNA-1271，EMT為上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化

ZEB1 1.0±0.3 1.1±0.5ab 1.0±0.5ab 1.1±0.4a 0.988 0.326組別對照組大黃素組吉西他濱聯(lián)合組F值P值MDR-1 3.6±0.7 2.2±0.3 2.3±0.4 1.3±0.1 20.572 0.000 miRNA-1271 0.3±0.1 1.1±0.3ab 1.0±0.4ab 3.8±0.8a 27.456 0.000 E-cadhcrin 0.6±0.2 1.1±0.4ab 0.9±0.3ab 2.8±0.5a 15.838 0.000 TWIST1 1.1±0.5 1.0±0.5ab 1.0±0.4ab 1.0±0.5a 0.894 0.374

2.3 流式細胞儀檢測MDR-1編碼的P糖蛋白（P-gp）陽性率 對照組、大黃素組、吉西他濱組與聯(lián)合組P-gp 陽性率分別為（42.6±3.5）%、（28.4±2.9）%、（23.6±1.8）%、（13.3±1.8）%，聯(lián)合組顯著低于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝12.777，P＝0.000）。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各組P糖蛋白表達情況

2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白及EMT 相關(guān)標(biāo)志物蛋白含量 聯(lián)合組可以顯著抑制Bcl-2、Caspase-3 及Survivin 表達，上調(diào)Bax 表達，降低Bcl-2/Bax 比值，其效果明顯高于吉西他濱組和大黃素組（P＜0.05）。聯(lián)合組E-cadhcrin 蛋白表達顯著高于其他組，TWIST1、ZEB1蛋白表達顯著低于其他組（P＜0.05）。見表3，圖2。

圖2 各組蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果：1為對照組，2為大黃素組，3為吉西他濱組，4為聯(lián)合組

3 討論

胰腺位于腹腔深側(cè)，早期胰腺癌癥狀相對不明顯，輕度癥狀容易被忽視，當(dāng)疾病確診時往往處于中晚期而錯失了手術(shù)根除治療的機會。手術(shù)治療的病人往往遠期效果不十分理想，容易發(fā)生遠器官轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。吉西他濱是晚期胰腺癌化療的首選藥物之一，但吉西他濱單一藥物作用不能很好地與胰腺癌病人發(fā)生反應(yīng)，吉西他濱與其他化療藥物合用歲能夠提高腫瘤的治療效果，但伴隨著高藥物毒性，病人的生存率和生存質(zhì)量得不到明顯改善［6］。研究中指出［7］，多數(shù)惡性腫瘤存在不同程度的多藥耐藥。因此，尋找一種毒副作用較小的藥物與吉西他濱聯(lián)用，提升化療對胰腺癌的作用效果，改善病人預(yù)后具有重大意義。大黃素是一種天然的化療輔助藥物，其能夠抑制多種惡性腫瘤疾病進展，多項研究顯示［8-10］，大黃素可以增強順鉑、紫杉醇等多種藥物對于惡性腫瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡作用。本研究對大黃素增強吉西他濱治療胰腺癌的效果并嘗試分析了可能的機制。本研究結(jié)果顯示，大黃素聯(lián)合吉西他濱可顯著抑制胰腺癌SW1990 細胞增殖和侵襲，SW1990 細胞凋亡率顯著更高，與其他三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示，大黃素在不增加吉西他濱劑量的條件下提升了吉西他濱對胰腺癌細胞的殺滅效率。細胞增殖和侵襲能力與細胞凋亡有著密切關(guān)系，惡性腫瘤細胞普遍存在細胞凋亡異常，大黃素聯(lián)合吉西他濱能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡增加，進而遏制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

化療后獲得性耐藥是惡性腫瘤治療效果不佳的重要原因［11］。本研究采用RT-PCR檢測MDR-1基因水平和編碼蛋白P-gp 水平，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3 及Survivin 水平。結(jié)果顯示，吉西他濱聯(lián)合大黃素組MDR-1 mRNA、P-gp、Bcl-2、Caspase-3及Survivin 表達顯著降低，Bax 表達顯著升高，與其他幾組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。研究顯示［12-13］，大黃素能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生活性氧（ROS），從而導(dǎo)致Bax 表達升高，Bcl-2 表達降低，導(dǎo)致線粒體Cytochrome C 大量釋放進入胞質(zhì)，激活Caspase3 活性，進而抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。Bcl-2 和Bax 表達異常輸尿管是導(dǎo)致吉西他濱耐藥的關(guān)鍵因素，NF-kB 能夠調(diào)控腫瘤細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3等細胞凋亡相關(guān)基因，進而一直腫瘤細胞凋亡。Survivin是NF-kB的下游蛋白，其能抑制Caspase 酶的活性從而抑制腫瘤細胞凋亡，在胰腺正常導(dǎo)管中機會不表達，在胰腺上皮內(nèi)瘤或胰腺導(dǎo)管腺癌中表達明顯上升。研究顯示［14］，吉西他濱等化療藥物作用于腫瘤細胞容易激活NF-kB 途徑，導(dǎo)致腫瘤細胞對于吉西他濱治療不敏感。因此，本研究推測大黃素能夠通過降低NF-kB 活性，進而增強吉西他濱對于胰腺癌的敏感性，并上調(diào)Bax 表達，下調(diào)Bcl-2/Bax比值，促進胰腺癌腫瘤細胞凋亡。

人miR-1271 定位于ARL10 基因的第2 內(nèi)含子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271 在多種惡性腫瘤中低表達，上調(diào)miR-1271 可顯著抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，并抑制TWIST1、ZEB1、FOXQ1等蛋白表達，從而發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用［15］。miRNA 除了參與癌

表3 各組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白及EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果/xˉ±s

細胞凋亡，還參與抑制EMT，EMT 是促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要病理機制。E-cadhcrin、TWIST1、ZEB1 是腫瘤細胞EMT 進程發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示［16］TWIST1、ZEB1可作為胰腺癌惡性程度的重要指示指標(biāo)。本研究中，在吉西他濱大黃素作用下，miRNA-1271 及E-cadhcrin mRNA顯著升高，同時，聯(lián)合組E-cadhcrin蛋白表達顯著高于其他組，TWIST1、ZEB1蛋白表達顯著低于其他組（P＜0.05）。大黃素可以通過調(diào)節(jié)多種信號抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲，研究發(fā)現(xiàn)［17］大黃素可以調(diào)節(jié)miR-1271 表達抑制惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為。因此，大黃素不僅可以增強吉西他濱對于胰腺癌細胞的藥效，還可以提高miRNA-1271水平，抑制胰腺癌細胞EMT轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抑制胰腺癌細胞侵襲遷移能力的效果。