王亮 王碧君 閆廣偉 丁燕子 崔晨航 付夢(mèng)宇 袁恩武

【摘要】 目的：分析卵泡液中的可溶性晚期糖化終產(chǎn)物受體（sRAGE）水平對(duì)多囊卵巢綜合征（PCOS）的影響。方法：選取2017年10月-2018年12月在本院接受IVF-ET助孕的患者，其中僅因輸卵管梗阻因素行IVF-ET患者49例為對(duì)照組，僅因PCOS因素行IVF-ET患者53例為試驗(yàn)組?；颊呔捎孟嗤倥怕逊桨?，比較兩組一般資料、性激素水平（LH/FSH、T、E2）、代謝參數(shù)（Gn總量、Gn天數(shù)、取卵數(shù)）以及卵泡液中sRAGE、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和C反應(yīng)蛋白（CRP）濃度;分析試驗(yàn)組卵泡液sRAGE水平與相關(guān)臨床參數(shù)的相關(guān)性;分析試驗(yàn)組卵泡液sRAGE與VEGF、CRP水平的相關(guān)性。結(jié)果：兩組年齡、BMI、E2、Gn天數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;試驗(yàn)組LH/FSH、T、Gn總量、取卵數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。試驗(yàn)組卵泡液sRAGE濃度低于對(duì)照組，VEGF和CRP因子濃度均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。試驗(yàn)組卵泡液sRAGE水平與Gn總量、VEGF、CRP水平均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與年齡、BMI、Gn天數(shù)、取卵數(shù)均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。結(jié)論：PCOS患者卵泡液sRAGE濃度降低，并與VEGF和CRP蛋白水平均呈負(fù)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 可溶性晚期糖化終產(chǎn)物受體 多囊卵巢綜合征 炎癥 體外受精-胚胎移植

[Abstract] Objective： To analyze the effect of soluble receptor for advanced glycation endproducts （sRAGE） level in follicular fluid on polycystic ovary syndrome （PCOS）. Method： Patients who received in vitro fertilization and embryo transfer （IVF-ET） in our hospital from October 2017 to December 2018 were selected， among them， 49 patients with IVF-ET only due to fallopian tube obstruction were in the control group， 53 patients with IVF-ET only due to PCOS were in the experimental group. All the patients were treated with the same ovulation promotion program. The general data， sex hormone levels （LH/FSH， T， E2）， metabolic parameters （total amount of Gn， Gn days， number of oocytes taken） and the concentrations of sRAGE， VEGF and CRP in follicular fluid were compared between the two groups; the correlation between sRAGE level of follicular fluid and related clinical parameters in experimental group were analyzed; the correlation between sRAGE， VEGF and CRP levels of follicular fluid in experimental group were analyzed. Result： There were no significant differences in age， BMI， E2 and Gn days between the two groups （P>0.05）. The LH/FSH， T， total amount of Gn and oocytes extracted number in the experimental group were higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The concentration of sRAGE in follicular fluid of the experimental group was lower than that of the control group， and the concentration of VEGF and CRP factors were higher than those of the control group （P<0.05）. The sRAGE level of follicular fluid in the experimental group were negatively correlated with the total amount of Gn， VEGF and CRP levels （P<0.05）， but not with age， BMI， Gn days and oocytes extracted number （P>0.05）. Conclusion： SRAGE concentration in follicular fluid decreased in PCOS patients， and were negatively correlated with VEGF and CRP protein levels.

多囊卵巢綜合征（PCOS）是目前已知的引發(fā)女性不孕因素的最常見(jiàn)疾病之一，是一種以高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變和稀發(fā)排卵為主要表現(xiàn)的代謝紊亂綜合征[1]。PCOS病因至今尚未闡明，可能是由某些遺傳基因與環(huán)境因素相互作用引起，其發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)除了胰島素抵抗及高雄激素血癥，目前研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致PCOS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[2]。

糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）是免疫球蛋白超家族的成員，其水平增加與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶激活和核因子信號(hào)通路激活有關(guān)，進(jìn)而產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、C-反應(yīng)蛋白（CPR），導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和介導(dǎo)多種疾病發(fā)生[3-4]。晚期糖基化終末產(chǎn)物的可溶性受體（sRAGE）是一種特殊的缺失受體膜鑲嵌區(qū)域和胞內(nèi)段的RAGE亞型。在循環(huán)血液及組織中，sRAGE與RAGE競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體，從而抑制RAGE誘導(dǎo)的多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，因此被稱為“誘餌受體”，作為保護(hù)因子阻止、延緩糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等，并可作為一種標(biāo)記物反映體內(nèi)的病理發(fā)展水平。

RAGE系統(tǒng)在介導(dǎo)卵巢微環(huán)境改變和激發(fā)PCOS炎癥反應(yīng)的作用已經(jīng)達(dá)成共識(shí)[5]，但sRAGE和炎性因子的關(guān)系尚未明確。Romero等[6]認(rèn)為早產(chǎn)患者羊水中sRAGE表達(dá)增加與其炎癥程度呈正相關(guān)，Rzepka等[7]觀察到血漿中sRAGE和CRP成負(fù)相關(guān)，進(jìn)而得出血清中高濃度sRAGE可避免早產(chǎn)的結(jié)論。在生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域，Merhi等[8]首先報(bào)道sRAGE與卵巢儲(chǔ)備功能呈正相關(guān)，本課題組也發(fā)現(xiàn)卵泡液中高sRAGE水平可預(yù)測(cè)較好的體外受精-胚胎移植（IVF-ET）結(jié)局[9]。但sRAGE與PCOS的關(guān)聯(lián)及其在PCOS疾病中的具體作用及機(jī)制尚不清楚。本研究比較了PCOS女性和非PCOS女性卵泡液中sRAGE的濃度差異，并分析了PCOS患者卵泡液sRAGE濃度與炎癥因子濃度的相關(guān)性，研究“誘餌受體”sRAGE在PCOS的作用，希望從PCOS的病因著手，尋找PCOS的治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月-2018年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET助孕的患者，其中僅因輸卵管梗阻因素行IVF-ET者49例為對(duì)照組，僅因PCOS因素行IVF-ET者53例（PCOS診斷根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[10]）為試驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤35歲，18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有糖尿病、慢性腎臟疾病、慢性代謝性疾病及子宮內(nèi)膜異位癥的婦女。該研究得到鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與者均簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本收集及測(cè)定

1.2.1 血清收集及內(nèi)分泌測(cè)定 月經(jīng)周期第2～4天晨起抽取空腹肘部靜脈血約5 mL于抗凝管中，測(cè)定性激素十項(xiàng)，記錄結(jié)果。

1.2.2 卵泡液的收集 患者均采用相同的長(zhǎng)長(zhǎng)促排卵方案[12]，其中試驗(yàn)組需提前口服去氧孕烯炔雌醇片（商品名：媽富隆，生產(chǎn)廠家：N.V.Organon，注冊(cè)證號(hào)：H20171176，規(guī)格：每片含去氧孕烯0.15 mg和炔雌醇30 μg），月經(jīng)第1天起給藥，1片/d，連續(xù)服21 d，隨后停藥7 d，為一周期。在停藥的第8天再次開(kāi)始一下周期，共計(jì)3個(gè)周期。兩組降調(diào)[月經(jīng)第2～3天予長(zhǎng)效GnRH-a皮下注射，即注射用醋酸曲普瑞林（商品名：達(dá)菲林，生產(chǎn)廠家：Ipsen Pharma，注冊(cè)證號(hào)：H20140298，規(guī)格：3.75 mg）]達(dá)標(biāo)后肌內(nèi)注射促性腺激素（Gn）：注射用重組人促卵泡激素[商品名：果納芬，生產(chǎn)廠家：Merck Serono SA Aubonne Branch，注冊(cè)證號(hào)：S20130055，規(guī)格：5.5 μg（75 IU）]，150～225 IU/次，1次/d。當(dāng)至少有2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑接近18 mm時(shí)，肌內(nèi)注射hCG[重組人絨促性素注射液（商品名：艾澤，生產(chǎn)廠家：Merck Serono S.p.A.，注冊(cè)證號(hào)：S20130091，規(guī)格：250 μg︰0.5 mL）] 250 μg，34～36 h后行取卵術(shù)。取第1管無(wú)血染卵泡液1 mL離心，-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.3 sRAGE、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及CRP測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），試劑盒由R&D公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。操作步驟：待測(cè)樣品以2 000 bpm離心15 min，取上清液待測(cè)。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品（按濃度剃度加入），樣品孔加入100 μL待測(cè)樣品，充分混勻后于37 ℃反應(yīng)120 min。實(shí)驗(yàn)緩沖液侵洗后，每孔中加入200 μL檢測(cè)抗體，封板膜密封，室溫孵育120 min。重復(fù)洗板4次，每孔中加入200 μL底物溶液，封好孔板，室溫孵育30 min。依序每孔中加入終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，混合30 s，反應(yīng)終止后立即檢測(cè)，用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)依次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品孔內(nèi)光密度（OD值）并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組一般資料（年齡、BMI）、性激素水平[促黃體生成素（LH）/促卵泡生成激素（FSH）、睪酮（T）、雌二醇（E2）]、代謝參數(shù)[Gn總量（校正藥物劑量均為IU）、Gn天數(shù)、取卵數(shù)]以及卵泡液中sRAGE、VEGF和CRP濃度;分析試驗(yàn)組卵泡液sRAGE水平與相關(guān)臨床參數(shù)的相關(guān)性;分析試驗(yàn)組卵泡液sRAGE與VEGF、CRP水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料、性激素水平和代謝參數(shù)比較兩組年齡、BMI、E2、Gn天數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;試驗(yàn)組LH/FSH、T、Gn總量、取卵數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組卵泡液sRAGE、VEGF和CRP濃度比較 試驗(yàn)組卵泡液sRAGE濃度（654.208±216.719）pg/mL，低于對(duì)照組的（1 631.081±845.306）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.132，P=0.000）;試驗(yàn)組卵泡液VEGF和CRP因子濃度分別為（157.173±24.373）、（9.359±1.605）pg/mL，均高于對(duì)照組的（108.869±12.682）、（5.620±1.363）pg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.404、12.630，P=0.000、0.000）。

2.3 試驗(yàn)組卵泡液sRAGE水平與相關(guān)臨床參數(shù)的相關(guān)性分析 試驗(yàn)組卵泡液sRAGE水平與Gn總量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.304，P=0.027），與年齡、BMI、Gn天數(shù)、取卵數(shù)均無(wú)相關(guān)性（r=0.077、0.125、0.032、-0.143，P=0.583、0.372、0.821、0.307）。

2.4 試驗(yàn)組卵泡液sRAGE與VEGF、CRP水平的相關(guān)性分析 在校正年齡和Gn劑量后，試驗(yàn)組卵泡液sRAGE與VEGF、CRP水平均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.319、-0.328，P=0.020、0.016），見(jiàn)圖1。

3 討論

過(guò)去的20年里，不斷有證據(jù)支持RAGE對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥的介導(dǎo)作用，這些過(guò)程改變卵巢微環(huán)境，可能會(huì)導(dǎo)致不孕[13]。但sRAGE在生殖領(lǐng)域的研究直到2014年才出現(xiàn)。Merhi等[8]發(fā)現(xiàn)卵泡液高sRAGE水平與卵巢儲(chǔ)備功能標(biāo)志物呈正相關(guān)，從而認(rèn)為sRAGE可能在卵泡發(fā)育環(huán)境中起積極作用[14]。然而，有些學(xué)者得出了相反的結(jié)論：卵泡內(nèi)sRAGE水平與胚胎發(fā)育呈負(fù)相關(guān)[15]。但本課題組相關(guān)研究顯示，卵泡液中sRAGE蛋白水平與本周期促性激素使用量成反比，和取卵數(shù)成正比，回歸分析結(jié)果表明卵泡液sRAGE較高的婦女IVF-ET助孕結(jié)局較好[9]。研究結(jié)果支持卵泡液中sRAGE在卵巢微環(huán)境中起保護(hù)作用的學(xué)說(shuō)。在本研究中，試驗(yàn)組卵泡液sRAGE濃度低于對(duì)照組（P<0.05），但卵泡液中低sRAGE水平是否與PCOS發(fā)生相關(guān)，目前尚不清楚。而且本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組卵泡液sRAGE水平與年齡、BMI、Gn天數(shù)、取卵數(shù)均無(wú)相關(guān)性（P>0.05），與Gn總量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），這表明sRAGE可能有利于生育內(nèi)環(huán)境，即生殖潛力。

關(guān)于sRAGE與VEGF的關(guān)聯(lián)目前也存在爭(zhēng)議。Goova等[16]發(fā)現(xiàn)高濃度sRAGE可以增強(qiáng)表皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)進(jìn)而加速皮膚傷口愈合，這可能與特定細(xì)胞特定部位的作用有關(guān)。但PCOS卵泡液中sRAGE濃度與VEGF間的關(guān)聯(lián)尚不清楚。在本研究中，試驗(yàn)組卵泡液sRAGE與VEGF水平呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明VEGF在PCOS的發(fā)病機(jī)制中血管發(fā)生的變化起主要作用[17]，且卵泡液VEGF濃度升高會(huì)降低輔助生殖技術(shù)的妊娠率[18]。因此，卵泡液中sRAGE與VEGF負(fù)相關(guān)是支持其保護(hù)作用的證據(jù)，至于sRAGE是否直接抑制VEGF是生成則需要進(jìn)一步做干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

炎癥通過(guò)影響下丘腦引起疾病-垂體-性腺軸導(dǎo)致卵泡閉鎖。最近的研究表明，慢性炎癥與PCOS發(fā)病機(jī)制和長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。CPR是炎癥重要的標(biāo)志之一，是由肝細(xì)胞在促炎性細(xì)胞因子（如IL-6和TNF-α）的刺激控制下產(chǎn)生的急性期反應(yīng)物。為了探討PCOS患者卵泡液中sRAGE濃度與炎癥因子的關(guān)系，本課題組用ELISA法進(jìn)行了測(cè)量，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組卵泡液CRP因子濃度高于對(duì)照組（P<0.05），與文獻(xiàn)[19]結(jié)果一致;而且試驗(yàn)組卵泡液sRAGE與CRP水平呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。因此，筆者推測(cè)sRAGE可能作為一個(gè)保護(hù)因子從炎癥視角預(yù)防PCOS的發(fā)生。

綜上所述，PCOS患者卵泡液sRAGE濃度降低，并與VEGF和CRP蛋白水平均呈負(fù)相關(guān)，故推測(cè)卵泡液中sRAGE可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而在PCOS中起保護(hù)作用。接下來(lái)筆者將進(jìn)行sRAGE干預(yù)實(shí)驗(yàn)，研究顆粒細(xì)胞、組織和整個(gè)動(dòng)物炎癥反應(yīng)，驗(yàn)證sRAGE是否對(duì)PCOS具有保護(hù)作用，進(jìn)而為其臨床治療提供新思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Witchel S F，Burghard A C，Tao R H，et al.The diagnosis and treatment of PCOS in adolescents：an update[J].Curr Opin Pediatr，2019，31（4）：562-569.

[2] Shorakae S，Ranasinha S，Abell S，et al.Inter-related effects of insulin resistance，hyperandrogenism，sympathetic dysfunction and chronic inflammation in PCOS[J].Clin Endocrinol（Oxf），2018，89（5）：628-633.

[3] Palimeri S，Palioura E，Diamanti-Kandarakis E.Current perspectives on the health risks associated with the consumption of advanced glycation end products：recommendations for dietary management[J].Diabetes Metab Syndr Obes，2015，8：415-426.

[4] Yang H，Liu H，Zeng Q，et al.Inhibition of HMGB1/RAGE-mediated endocytosis by HMGB1 antagonist box A，anti-HMGB1 antibodies，and cholinergic agonists suppresses inflammation[J].Mol Med，2019，25（1）：13.

[5] Merhi Z.Advanced glycation end products and their relevance in female reproduction[J].Hum Reprod，2014，29（1）：135-145.

[6] Romero R，Espinoza J，Hassan S，et al.Soluble receptor for advanced glycation end products（sRAGE） and endogenous secretory RAGE（esRAGE） in amniotic fluid：modulation by infection and inflammation[J].J Perinat Med，2008，36（5）：388-398.

[7] Rzepka R，Dolegowska B，Rajewska A，et al.Soluble and Endogenous Secretory Receptors for Advanced Glycation End Products in Threatened Preterm Labor and Preterm Premature Rupture of Fetal Membranes[J].Biomed Res Int，2015，2015：568042.

[8] Merhi Z，Irani M，Doswell A D，et al.Follicular fluid soluble receptor for advanced glycation end-products（sRAGE）：a potential indicator of ovarian reserve[J].J Clin Endocrinol Metab，2014，99（2）：E226-E233.

[9] Wang B，Li J，Yang Q，et al.Decreased levels of sRAGE in follicular fluid from patients with PCOS[J].Reproduction. 2017，153（3）：285-292.

[10] Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus workshop group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome（PCOS）[J].Hum Reprod，2004，19（1）：41-47.

[11] He C T，Lee C H，Hsieh C H，et al.Soluble form of receptor for advanced glycation end products is associated with obesity and metabolic syndrome in adolescents[J].Int J Endocrinol，2014，2014：657607.

[12]胡琳莉，代瑋，孫瑩璞.長(zhǎng)效/短效GnRH激動(dòng)劑長(zhǎng)方案分別用于卵泡期/黃體期的臨床效果比較[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2016，25（10）：919-925.

[13] Liu M，Gao J，Zhang Y，et al.Serum levels of TSP-1，NF-κB and TGF-β1 in polycystic ovarian syndrome （PCOS） patients in northern China suggest PCOS is associated with chronic inflammation[J].Clin Endocrinol（Oxf），2015，83（6）：913-922.

[14] Irani M，Merhi Z.Role of vitamin D in ovarian physiology and its implication in reproduction： a systematic review[J].Fertil Steril，2014，102（2）：460-468.

[15] Bonetti T C，Borges E Jr，Braga D P，et al.Intrafollicular soluble receptor for advanced glycation end products（sRAGE） and embryo quality in assisted reproduction[J].Reprod Biomed Online，2013，26（1）：62-67.

[16] Goova M T，Li J，Kislinger T，et al.Blockade of Receptor for Advanced Glycation End-Products Restores Effective Wound Healing in Diabetic Mice[J].The American Journal of Pathology，2001，159（2）：513-525.

[17] Tal R，Seifer D B，Grazi R V，et al.Follicular fluid placental growth factor is increased in polycystic ovarian syndrome：correlation with ovarian stimulation[J].Reproductive Biology and Endocrinology，2014，12（1）：82.

[18] Fortin C S，Leader A，Mahutte N，et al.Gene expression analysis of follicular cells revealed inflammation as a potential IVF failure cause[J].J Assist Reprod Genet，2019，36（6）：1195-1210.

[19] Blumenfeld Z.The Possible Practical Implication of High CRP Levels in PCOS[J].Clin Med Insights Reprod Health，2019，13：1179558119861936.

（收稿日期：2019-12-12） （本文編輯：董悅）