劉凱歌，龔繁榮，宋云鵬，張麗麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海201403)

甜椒(CapsicumannuumL.)營養(yǎng)豐富、色澤鮮艷，屬于經(jīng)濟(jì)價值較高的溫室作物之一，適宜生長溫度為27—28℃，夏季持續(xù)高溫常造成其植株生長不良和落花落果等現(xiàn)象[1]。 噴施外源物質(zhì)作為一種提高植物抗逆性簡便、高效的方法，受到越來越多的重視[2]。6-BA(6-芐基腺嘌呤)是一種較活躍的細(xì)胞分裂素，對于緩解生物和非生物脅迫有重要的作用[3]。關(guān)于6-BA調(diào)節(jié)植物脅迫的生理機(jī)制主要有以下幾個方面：改善植物光合作用[4-5]，提高植物對光能的分配利用[6]；提高抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化程度，進(jìn)而保護(hù)膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[7]；提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累[8]；提高植物體內(nèi)ATP的含量，改善植物能量代謝失調(diào)[9]。目前，關(guān)于6-BA調(diào)控甜椒耐高溫的生理機(jī)制鮮有報道。本試驗以甜椒幼苗為材料，研究6-BA處理對高溫脅迫下甜椒葉片葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、O-2· 產(chǎn)生速率、各種抗氧化酶活性以及MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響，以期從光能的吸收、能量轉(zhuǎn)換、電子傳遞以及抗氧化酶調(diào)節(jié)等方面明確6-BA提高甜椒幼苗抗高溫脅迫的作用機(jī)制，為利用6-BA緩解高溫脅迫對甜椒幼苗產(chǎn)生的危害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)和處理

試驗于2014年5月14日在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。供試甜椒P13201種子和光照培養(yǎng)箱均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，6-BA購自美國Sigma公司。種子經(jīng)溫水浸種后播于草炭、蛭石和珍珠巖組成的混合基質(zhì)中。甜椒幼苗出土后進(jìn)行日本山崎甜椒營養(yǎng)液和清水的隔天灌溉。生長溫度控制在28℃18℃(晝夜)。當(dāng)甜椒幼苗具有6—7片真葉時，挑選生長一致的植株，置于溫度為28℃18℃(晝夜)、光照強(qiáng)度為30 000 lx、相對濕度為70%的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行常溫營養(yǎng)液栽培。培養(yǎng)2 d后將試驗材料分為7組(每組10株)，選取其中3組噴施蒸餾水，另外3組噴施10 μmolL 6-BA[10]，剩余 1 組噴施蒸餾水后直接取樣測定生長指標(biāo)以及生理生化指標(biāo)，噴施時間為每天早上8：00左右。常溫處理3 d后，分別從噴施蒸餾水和6-BA的處理中各選1 組取樣測定相應(yīng)指標(biāo)，然后把剩余2組噴施蒸餾水的處理分別置于常溫(28℃18℃，晝夜)和高溫(40℃30℃，晝夜)的光照培養(yǎng)箱中，噴施6-BA的2組也做同樣處理，其他條件同上。處理7 d(高溫處理4 d)后，分別對上述4組進(jìn)行取樣，測定相應(yīng)指標(biāo)。將上述處理進(jìn)行編號：①常溫噴施蒸餾水處理為 CK組；②常溫噴施10 μmolL 6-BA處理為 S1組；③高溫噴施蒸餾水處理為 S2組；④高溫噴施10 μmolL 6-BA處理為S3組；每處理3次重復(fù)。

1.2 測定指標(biāo)及方法

用直尺測定甜椒幼苗株高，用電子游標(biāo)卡尺測定莖基部作為莖粗，用電子秤稱取地上、地下部鮮重，然后105℃殺青15 min，置于75℃烘干至恒重后，稱取地上、地下部干重。葉綠素含量參照Zhu等[11]的方法測定。葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用PAM-2100便攜式調(diào)制熒光儀(Walz，Effeltrich，Germany)測定，各熒光指標(biāo)參考張永平等[12]的方法。電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀測定，將鮮樣沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗2次，用打孔器取樣0.3 g，裝入大試管，加入15 mL蒸餾水，抽氣3次，室溫?fù)u動24h，測電導(dǎo)率S1，然后封口沸水浴25 min，冷卻，平衡10 min后測電導(dǎo)率S2，同時測定蒸餾水電導(dǎo)率S0。相對電導(dǎo)率=(S1-S0)(S2-S0)×100%。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[13]，O-2·產(chǎn)生速率參考Wang等[14]的方法測定，SOD活性的測定參考Giannopolitis等[15]的方法，POD活性的測定采用Cakmak等[16]的方法，APX活性的測定采用Nakano等[17]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003繪圖，采用SPSS統(tǒng)計軟件的獨立樣本t檢驗、單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并使用Tukey法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源6-BA對高溫脅迫下甜椒幼苗生長的影響

如表1所示， 試驗處理3 d后，S1組和CK組間的甜椒幼苗各生長指標(biāo)沒有顯著差異；處理7 d后，S1組甜椒幼苗各生長指標(biāo)均顯著高于CK組(除莖粗外)。高溫處理導(dǎo)致甜椒幼苗各生長指標(biāo)顯著降低，S2組甜椒幼苗的株高、莖粗、地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重相比CK組分別下降了25.7%、5.2%、57.3%、63.8%、12.8%、38.9%；噴施10 μmolL 6-BA可以明顯緩解高溫造成的傷害，S3組甜椒幼苗各生長指標(biāo)相比S2組顯著升高，其株高、莖粗、地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重分別增加了34.7%、5.3%、 113.9%、 143.3%、19.9%、 110.6%。由此可知，常溫下噴施10 μmolL 6-BA對甜椒植株并沒有脅迫作用，且在處理7 d后對植株的生長有明顯的促進(jìn)作用。高溫阻礙了甜椒植株的生長，10 μmolL 6-BA處理可明顯緩解高溫造成的傷害。

表1 外源6-BA對高溫脅迫下甜椒幼苗生長的影響

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，相同處理時間同列數(shù)據(jù)后*或不同字母表示差異達(dá)5%顯著水平，下同

2.2 外源6-BA對高溫脅迫下甜椒幼苗葉片葉綠素含量的影響

如表2所示，S1組較CK組甜椒幼苗葉片葉綠素a含量略有上升，但差異不顯著，葉綠素b含量顯著下降，總?cè)~綠素含量(葉綠素a+b)無顯著差異，說明常溫噴施10 μmolL 6-BA對甜椒植株的光能吸收沒有顯著影響。處理7 d后，S2組甜椒幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量大幅下降，相比CK組分別下降了66.0%、41.5%和62.3%。噴施10 μmolL 6-BA可以明顯緩解葉綠素含量的降低，相比S2組，S3組甜椒幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量分別上升了 103.3%、 106.9%和 104.2%?？梢姡邷貙?dǎo)致甜椒幼苗葉片葉綠素含量顯著下降，而10 μmolL 6-BA可緩解葉綠素含量的降低，從而維持正常的光合作用和甜椒幼苗的正常生長。

表2 外源6-BA對高溫脅迫下甜椒幼苗葉片葉綠素含量的影響

2.3 外源6-BA對高溫脅迫下甜椒幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖1可知，試驗處理3 d后，相比CK組，S1組甜椒幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FvFm、Yield、φPSII、NPQ無顯著差異；處理7 d后，S1組甜椒幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Yield、φPSII、NPQ與CK組差異顯著，F(xiàn)vFm與CK組無顯著差異；高溫處理導(dǎo)致甜椒幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FvFm、Yield、φPSII顯著降低，NPQ顯著升高，其中葉綠素?zé)晒鈪?shù)FvFm、Yield、φPSII分別下降了40%、39.2%、28%，NPQ升高了34.9%；噴施10 μmolL 6-BA可以明顯緩解這一狀況，相比CK組，S3組甜椒幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)FvFm、Yield、NPQ無顯著差異，φPSII顯著升高，相比S2組，其葉綠素?zé)晒鈪?shù)FvFm、Yield、φPSII、NPQ存在顯著差異，其中FvFm、Yield、φPSII分別升高了59.8%、62.8%、68%，NPQ下降了23.6%?？梢?，高溫嚴(yán)重降低了甜椒幼苗葉片葉綠素的光能利用率，而噴施10 μmolL 6-BA能明顯緩解這一狀況。

2.4 外源6-BA對高溫脅迫下甜椒幼苗葉片超氧陰離子和抗氧化酶活性的影響

如圖2A所示，試驗處理3 d和7 d后，S1組甜椒幼苗葉片的O-2· 產(chǎn)生速率和CK組相比略有下降，但差異不顯著；處理7 d后，高溫導(dǎo)致甜椒幼苗葉片的O-2· 產(chǎn)生速率顯著升高， S2組相比CK組O-2· 產(chǎn)生速率升高了90.4%。噴施10 μmolL 6-BA可明顯緩解甜椒幼苗葉片O-2· 產(chǎn)生速率的升高，S3組與CK組無顯著差異，較S2組O2-·產(chǎn)生速率顯著下降了51.4%。由圖2B、C、D可見，處理3 d和7 d后，S1組甜椒幼苗葉片SOD、POD、APX酶活性顯著高于CK組；處理7 d 后，S2組甜椒幼苗葉片SOD酶活性顯著低于CK組，但其POD和APX酶活性有所升高，其中POD酶活性顯著升高。S1組較S2組甜椒幼苗葉片的SOD、POD、APX酶活性分別提高了37.2%、20.6%、19.1%。由此可知，高溫導(dǎo)致甜椒幼苗葉片的O-2· 產(chǎn)生速率升高，使其受到脅迫傷害，而噴施10 μmolL 6-BA可有效增加SOD、POD、APX酶活性，以清除O-2· 的產(chǎn)生，從而緩解植物受到的脅迫傷害。

2.5 外源6-BA對高溫脅迫下甜椒幼苗葉片MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響

如圖3所示，試驗處理3 d后，S1組甜椒幼苗葉片MDA含量和相對電導(dǎo)率與CK組均無顯著差異；處理7 d后，S1組MDA含量較CK組顯著降低，而二者的相對電導(dǎo)率差異不顯著。高溫處理導(dǎo)致甜椒幼苗葉片的MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著升高，S2組相比CK組MDA含量和相對電導(dǎo)率分別上升了70.1%和37.0%。與S2組相比，S3組甜椒幼苗葉片的MDA含量和相對電導(dǎo)率分別降低了23.8%和28.2%。可見，高溫導(dǎo)致甜椒幼苗葉片中有害物質(zhì)MDA積累更多，從而使細(xì)胞膜滲透率增大，而噴施10 μmolL 6-BA可有效緩解這一狀況。

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞分裂素是一類具有腺嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)的植物激素，它在高等植物中通過對細(xì)胞分裂與分化的調(diào)節(jié)而廣泛參與對植物生長發(fā)育的調(diào)控。6-BA作為一種外源類細(xì)胞分裂素也有類似的效果，但作用效果因處理濃度、作物類型、處理時植株發(fā)育狀態(tài)會有所差異[18]。夢云等[19]研究發(fā)現(xiàn)，300 mgL 6-BA對‘天紅2號’蘋果苗腋芽萌發(fā)的作用效果最好。張海娜等[20]發(fā)現(xiàn)，10 mgL 6-BA增加了棉花的株高、單株出生葉數(shù)、單株葉面積和單株干重。本研究中，常溫下噴施10 μmolL 6-BA增加了甜椒幼苗的生長量，說明該濃度未對植株產(chǎn)生脅迫作用，而且會輕度刺激植物生長。高溫脅迫會阻礙植物生長并降低植物產(chǎn)量。本研究中，高溫處理4 d后，甜椒幼苗各項生長指標(biāo)均出現(xiàn)顯著降低，噴施6-BA后植物生長逐步恢復(fù)到正常水平，說明6-BA對高溫脅迫有一定緩解作用。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，在光合作用中起著吸能和轉(zhuǎn)能的作用。葉綠素的破壞與降解會直接導(dǎo)致光合作用效率的降低，其含量的高低在很大程度上反映了葉片光合作用的強(qiáng)弱[21]。趙莉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA顯著提高了香水百合葉片葉綠素的含量。本研究中常溫下不同時間段外施6-BA除對葉綠素b含量有顯著促進(jìn)外，葉綠素a和葉綠素總含量也有上升，但均不顯著，表明6-BA雖對植株光能吸收沒有顯著促進(jìn)作用，但顯然沒有抑制作用。葉綠素的生物合成需要通過一系列的酶促反應(yīng)，溫度過高或過低都會抑制酶反應(yīng)的進(jìn)行，甚至?xí)茐脑械娜~綠素[9]，所以溫度對植物體內(nèi)葉綠素含量有重要的影響。汪炳良等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在35℃高溫脅迫下，花椰菜葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量比對照下降25%以上，本研究得到了類似的結(jié)果，這可能是因為高溫脅迫不僅降低了葉綠素的合成速率， 而且由于高溫下活性氧大量積累，加速了葉綠素的降解。噴施外源6-BA以后，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量的下降得到了明顯的緩解，這可能是由于高溫條件下6-BA促進(jìn)了葉綠素的合成，如6-BA 處理小麥葉片可促進(jìn)葉綠素前體D-氨基乙酰丙酸的合成[24]。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化能在一定程度上說明植物對溫度脅迫的耐受能力[25]。PSII實際光化學(xué)量子產(chǎn)量Yield反映了PSII反應(yīng)中心在部分關(guān)閉情況下的實際原初光能捕獲效率；PSII原初光能轉(zhuǎn)換效率FvFm反映PSII反應(yīng)中心光能轉(zhuǎn)換效率；PSII實際光化學(xué)效率φPSII常用來反映電子在PSII與PSI的傳遞情況，與碳同化有密切聯(lián)系[26]。NPQ表示非光化學(xué)淬滅，反映的是PSII天線色素吸收光能中不能用于光合電子傳遞而以熱形式耗散掉的光能部分[27]，植物通過熱耗散的形式減小外界環(huán)境對機(jī)體的傷害。本研究中，常溫下噴施6-BA對葉綠素?zé)晒鈪?shù)Yield、FvFm、φPSII有不同程度的促進(jìn)，其中Yield、φPSII顯著升高，NPQ顯著降低，說明常溫下6-BA對甜椒葉片光能利用率有一定促進(jìn)作用。Downes等[28]發(fā)現(xiàn)，6-BA通過調(diào)節(jié)核內(nèi)編碼葉綠體蛋白基因的表達(dá)，增加了光誘導(dǎo)的硝酸還原酶mRNA和捕光色素結(jié)合蛋白mRNA的含量，從這一點上可以推測6-BA在光能的吸收上起到了促進(jìn)作用。另外有研究表明，6-BA 處理菠菜葉綠體能促進(jìn)循環(huán)和非循環(huán)光合磷酸化反應(yīng)，提高葉綠體的偶聯(lián)程度及高能態(tài)的累積[29]，表明6-BA在光能傳遞利用率上的促進(jìn)作用。本研究的結(jié)果和上述結(jié)果類似，高溫脅迫導(dǎo)致Yield、FvFm、φPSII顯著降低，說明高溫脅迫對光能吸收、轉(zhuǎn)換、傳遞都產(chǎn)生了抑制作用，NPQ的升高也進(jìn)一步說明植物在光能傳遞上受阻，只能通過熱耗散的形式避免植物進(jìn)一步遭到傷害。高溫脅迫下施加6-BA顯著提高了Yield、FvFm、φPSII，降低了NPQ，說明6-BA可以增加PSII反應(yīng)中心的開放比例，使光能捕獲效率增大，增加氧化態(tài)QA(電子傳遞鏈中PSII受體側(cè)原初醌受體)被還原的比例，說明被用于傳遞的光能增加了，進(jìn)一步導(dǎo)致碳同化效率的增加。

在非逆境條件下植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡，但在逆境條件下，平衡會被打破，自由基會大量增加，從而導(dǎo)致植物受到傷害[30]。本研究中，常溫下噴施6-BA導(dǎo)致超氧陰離子降低，但不顯著。這可能是由于6-BA引發(fā)了一個保護(hù)程序的響應(yīng)，從常溫下抗氧化酶SOD、POD、APX的升高可以得到這一驗證。從對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析中可以知道，高溫脅迫抑制了電子傳遞，增強(qiáng)了分子態(tài)氧為受體的支路反應(yīng)，從而導(dǎo)致了活性氧積累的增加，本研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫后超氧陰離子顯著升高。脂質(zhì)過氧化是生命體的自然代謝過程，脂質(zhì)中的多聚不飽和脂肪酸易受ROS攻擊，形成脂質(zhì)氫過氧化物和脂質(zhì)降解的氧化產(chǎn)物(如MDA)，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜正常的結(jié)構(gòu)和功能[31]。本研究中，高溫脅迫后，MDA含量和相對電導(dǎo)率明顯升高，從而佐證了高溫脅迫后導(dǎo)致的超氧陰離子升高后一系列的后續(xù)反應(yīng)。高溫脅迫下噴施6-BA后，超氧陰離子、MDA含量和相對電導(dǎo)率都不同程度的顯著降低，說明6-BA對超氧陰離子的清除有一定促進(jìn)作用。植物清除活性氧主要依靠抗氧化酶類，包括超氧化物歧化酶、 過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化氫酶等[32]。有研究表明，高溫脅迫下SOD活性會降低[33]，APX活性會升高[34]。本研究有類似的結(jié)果，高溫脅迫后，SOD活性顯著降低，POD、APX活性顯著升高，表明高溫脅迫刺激了抗氧化酶活性的升高，但溫度過高導(dǎo)致了部分SOD降解，從而低于正常水平。高溫脅迫下噴施6-BA明顯提高了以上3種酶的活性，這有利于其及時清除活性氧自由基，減少膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的生成，保護(hù)膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整。對于6-BA的這種促進(jìn)作用，有報道稱6-BA可促進(jìn)低溫逆境下SOD的從頭合成[35]，表明6-BA參與了抗氧化酶的合成過程，可能是6-BA刺激了合成過程中一些關(guān)鍵酶的表達(dá)。

綜上所述，高溫脅迫顯著抑制甜椒幼苗的生長，而10 μmolL 6-BA能有效緩解高溫對甜椒幼苗產(chǎn)生的傷害，其可能的生理生化機(jī)制為：6-BA在高溫脅迫下促進(jìn)了葉綠素的合成，緩解了高溫導(dǎo)致的葉綠素含量降低，從而維持正常的光合作用；6-BA在光能的吸收、能量轉(zhuǎn)換、電子傳遞上起到了促進(jìn)作用，使植物對光能的利用效率顯著提升；6-BA增強(qiáng)了體內(nèi)抗氧化酶活性以減輕膜脂過氧化作用，進(jìn)而降低超氧陰離子的產(chǎn)生速率及有害物質(zhì)MDA的積累。此外，低濃度6-BA(10 μmolL)在常溫下對甜椒幼苗生長具有一定的刺激作用。