石雨鑫，湯春宇，譚 夢(mèng)，何培民，2，邵 留，2*

(1上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；2上海海洋大學(xué)水域環(huán)境生態(tài)上海高校工程研究中心，上海 201306)

在水生態(tài)系統(tǒng)中，藻類快速生長(zhǎng)導(dǎo)致的水華爆發(fā)是水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要表征之一[1]。水華能顯著影響水體質(zhì)量，如使水體發(fā)出異味[2]，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致水體內(nèi)生物多樣性減少等[3-4]。富營(yíng)養(yǎng)化引發(fā)的水華現(xiàn)象已成為世界公認(rèn)的主要環(huán)境問題之一[5-7]，因此通過科學(xué)有效的手段抑制有害藻類繁殖、控制水華爆發(fā)是亟待解決的問題。

近年來，植物化感作用已經(jīng)成為防治水華的一條新型有效途徑[8-9]。植物化感作用是指植物(包括微生物)向環(huán)境中釋放各種化學(xué)物質(zhì)，從而直接或間接促進(jìn)或抑制其他個(gè)體或自身生長(zhǎng)發(fā)育的現(xiàn)象[10]。植物(包括微生物)釋放的次生代謝產(chǎn)物，被稱為化感物質(zhì)[11]。利用化感物質(zhì)控制藻類具有溫和、低毒以及對(duì)環(huán)境親和等優(yōu)勢(shì)[12]，為恢復(fù)良好的水生態(tài)環(huán)境提供了新的思路。

現(xiàn)有研究表明，多種水生植物及陸生植物提取液均具有較強(qiáng)的化感抑藻作用[13-20]。最近幾年，有研究者另辟蹊徑，將有害藻類控制與入侵植物資源化利用相結(jié)合，指出不少水生及陸生入侵植物提取物同樣具有化感抑藻效應(yīng)[21-24]。將入侵植物提取物用于有害水華的防控技術(shù)，不僅豐富了抑藻化感植物備選庫(kù)，同時(shí)也為入侵植物的資源化利用提供了新的途徑。但目前有關(guān)入侵植物化感抑藻的研究多偏重于研究某一種入侵植物的抑藻效應(yīng)，缺乏系統(tǒng)性,且由于試驗(yàn)條件等不同，不同研究成果無法直接進(jìn)行比較；此外現(xiàn)有報(bào)道的研究指標(biāo)多集中于提取液對(duì)藻類細(xì)胞密度及葉綠素含量等表觀指標(biāo)的影響[9,25]，較少涉及機(jī)理剖析。

葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量技術(shù)在不對(duì)植物本身造成損傷的前提下，能夠提供不同的熒光參數(shù)，包括最大量子產(chǎn)額(FvFm)、有效量子產(chǎn)額(YII)、電子傳遞效率(ETRmax)等，為植物的生理變化提供有效信息[26]，并能夠在藻體形態(tài)或密度發(fā)生明顯變化之前識(shí)別光合狀態(tài)的變化[27]，是一種快速靈敏地估算植物光合作用能力的有效技術(shù)。本試驗(yàn)基于葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定技術(shù)，著重研究4種常見入侵植物的水提液對(duì)3種有害水華藻生長(zhǎng)及光合系統(tǒng)的影響，以期通過比較不同入侵植物的抑藻效果及作用機(jī)理分析，篩選出高效、靶向性明確的植物源抑藻劑，為富營(yíng)養(yǎng)化水體目標(biāo)水華的防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料一年蓬、加拿大一枝黃花、喜旱蓮子草和水葫蘆均采自上海臨港地區(qū)。將植物材料采回后，洗凈烘干，粉碎至粒徑270μm后保存?zhèn)溆谩?/p>

黃絲藻、銅綠微囊藻和水華微囊藻藻種均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，3種藻均為蘇州河道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)種[28-29]，也是水華爆發(fā)的優(yōu)勢(shì)藻種[30-31]。購(gòu)回的藻種用BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000—2 500 lx，光暗時(shí)間為12 h∶12 h，每天定時(shí)搖晃2次，并鏡檢藻種生長(zhǎng)情況。當(dāng)藻體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行分瓶試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 入侵植物水提液的制備

稱取適量烘干的植物粉末，以1∶20的固液比加入蒸餾水進(jìn)行超聲波常溫提取2 h，連續(xù)提取2次?；旌纤嵋汉笠? 000 rmin離心3 min，過濾以去除沉淀，并用0.22 μm濾膜過濾以去除微生物的影響，定容至250 mL，得到清澈的干粉質(zhì)量濃度為7.5 gL的水提液母液備用。

1.2.2 入侵植物水提液抑藻試驗(yàn)

設(shè)置4個(gè)試驗(yàn)組(一年蓬、加拿大一枝黃花、喜旱蓮子草、水葫蘆)及1個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)平行。于250 mL錐形瓶中分別加入60 mL BG-11培養(yǎng)液和60 mL植物水提液(對(duì)照組加入60 mL蒸餾水)，并加入30 mL藻液。試驗(yàn)用水提液最終干粉質(zhì)量濃度為3 gL。

1.2.3 入侵植物水提液對(duì)藻類生長(zhǎng)及光合作用影響的參數(shù)測(cè)定

植物水提液對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響通過藻細(xì)胞計(jì)數(shù)及測(cè)量藻體葉綠素?zé)晒鈪?shù)來反映，每隔24 h測(cè)1次藻細(xì)胞數(shù)及藻體葉綠素?zé)晒鈪?shù)，連續(xù)測(cè)量96 h。

利用浮游植物計(jì)數(shù)框?qū)υ寮?xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用浮游植物分類熒光儀(PHYTO-PAM，德國(guó) WALZ)測(cè)定。測(cè)量方法參照胡廷尖等[23]，并根據(jù)不同藻種對(duì)光參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和圖表繪制采用Excel 2017軟件和SPSS 24.0軟件。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，所有數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布數(shù)據(jù)(S-W檢驗(yàn))。利用SPSS 24.0軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照組和處理組之間的均值比較，P<0.05表示兩組之間差異顯著，P<0.01表示兩組之間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同入侵植物水提液對(duì)水華藻細(xì)胞數(shù)量的影響

2.1.1 對(duì)黃絲藻生長(zhǎng)的影響

不同入侵植物水提液對(duì)初始密度為1.4×106個(gè)mL的黃絲藻生長(zhǎng)影響如圖1所示。對(duì)照組藻密度從試驗(yàn)開始至結(jié)束一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，藻細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好；水葫蘆和喜旱蓮子草水提液在前48 h抑藻效果不顯著，甚至出現(xiàn)短期促進(jìn)作用，但72 h時(shí)兩試驗(yàn)組藻數(shù)量突降明顯，96 h時(shí)水葫蘆和喜旱蓮子草水提液對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)到90.34%和73.71%，抑制作用顯著。添加加拿大一枝黃花水提液的試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量在試驗(yàn)期間一直處于增長(zhǎng)狀態(tài)，且前72 h試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量均大于對(duì)照組。一年蓬水提液試驗(yàn)組前72 h對(duì)黃絲藻生長(zhǎng)的抑制效果不顯著，96 h時(shí)抑制率達(dá)70%以上。總體來看，各植物水提液對(duì)黃絲藻生長(zhǎng)抑制作用表現(xiàn)為水葫蘆>喜旱蓮子草、一年蓬>加拿大一枝黃花。

2.1.2 對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

不同入侵植物水提液對(duì)初始密度為3.25×106個(gè)mL的銅綠微囊藻生長(zhǎng)影響如圖2所示。各試驗(yàn)組自開始就均表現(xiàn)為抑制作用，處理24 h后各試驗(yàn)組藻細(xì)胞顏色變透明，出現(xiàn)黃化、大量死亡的現(xiàn)象，總體上試驗(yàn)組均表現(xiàn)出隨時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞數(shù)量逐漸降低的趨勢(shì)。96 h時(shí)各試驗(yàn)組植物水提液對(duì)銅綠微囊藻藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均能達(dá)到60%以上，抑制效果顯著，加拿大一枝黃花水提液的抑制作用略高于其他3個(gè)試驗(yàn)組，96 h時(shí)抑制率達(dá)到73.02%。各試驗(yàn)組對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用表現(xiàn)為加拿大一枝黃花>一年蓬、水葫蘆、喜旱蓮子草。

2.1.3 對(duì)水華微囊藻生長(zhǎng)的影響

不同入侵植物水提液對(duì)初始密度為1.71×106個(gè)mL的水華微囊藻生長(zhǎng)影響如圖3所示。對(duì)照組藻細(xì)胞數(shù)量從試驗(yàn)初始階段不斷增長(zhǎng)，且藻細(xì)胞完整、長(zhǎng)勢(shì)良好。水葫蘆水提液處理的藻細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)先下降后升高的現(xiàn)象，藻細(xì)胞數(shù)量始終低于對(duì)照組，抑制作用顯著。喜旱蓮子草和加拿大一枝黃花試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量均從48 h時(shí)開始出現(xiàn)明顯降低，96 h時(shí)略增長(zhǎng)，抑制率分別達(dá)到75.65%和72.66%，抑制作用顯著。添加一年蓬水提液處理的試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量同樣出現(xiàn)先降低后升高的現(xiàn)象，96 h時(shí)抑制作用依然顯著。水華微囊藻藻細(xì)胞抑制效果總體上表現(xiàn)為：喜旱蓮子草>加拿大一枝黃花>一年蓬>水葫蘆。

2.2 不同入侵植物水提液對(duì)水華藻光合熒光特性的影響

在藻類葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，F(xiàn)vFm用來表示光系統(tǒng)II的最大光合效率，反映光系統(tǒng)II的最大光能轉(zhuǎn)化效率和藻類潛在光合作用能力。正常情況下，F(xiàn)vFm可以維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，當(dāng)受到外界脅迫時(shí)，F(xiàn)vFm值會(huì)明顯下降。YII表示光系統(tǒng)II的實(shí)際光合效率，可以用來評(píng)估光系統(tǒng)II吸收的能量用于光合作用的比例，YII值越高，表明光系統(tǒng)II的光合效率越高[32]。

2.2.1 對(duì)黃絲藻光合熒光特性的影響

由圖4、5可以看出，試驗(yàn)期間對(duì)照組黃絲藻的FvFm值和YII值一直維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。相比對(duì)照組，各試驗(yàn)組在24 h時(shí)黃絲藻的FvFm值均出現(xiàn)明顯降低。水葫蘆水提液試驗(yàn)組黃絲藻的FvFm值有一定的波動(dòng)，處理24 h后出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，96 h時(shí)與對(duì)照組差異不顯著。喜旱蓮子草水提液試驗(yàn)組自試驗(yàn)開始黃絲藻的FvFm值和YII值就下降至較低水平，96 h時(shí)FvFm值僅為對(duì)照組的1.47%，抑制效果極顯著。加拿大一枝黃花水提液和一年蓬水提液試驗(yàn)組黃絲藻的FvFm值均出現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，48 h時(shí)FvFm值分別為對(duì)照組的50.79%和33.33%，YII值也出現(xiàn)緩慢升高的趨勢(shì)，96 h時(shí)與對(duì)照組無顯著差異。從FvFm值和YII值綜合分析，4種植物水提液對(duì)黃絲藻光合熒光特性的抑制效果表現(xiàn)為喜旱蓮子草>一年蓬>加拿大一枝黃花>水葫蘆。

2.2.2 對(duì)銅綠微囊藻光合熒光特性的影響

由圖6、圖7可見，試驗(yàn)期間對(duì)照組銅綠微囊藻的FvFm值及YII值穩(wěn)中有升，各試驗(yàn)組銅綠微囊藻的FvFm值及YII值在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)不同程度的下降。水葫蘆水提液試驗(yàn)組在24 h時(shí)降低后開始逐漸增加，但96 h時(shí)降到最低值，銅綠微囊藻的FvFm值為對(duì)照組的14.03%，抑制作用顯著。喜旱蓮子草水提液處理的銅綠微囊藻FvFm值和YII值在48 h時(shí)出現(xiàn)最小值，分別為對(duì)照組的32.62%和21.42%，處理48 h后出現(xiàn)小幅上漲。加拿大一枝黃花水提液處理的銅綠微囊藻FvFm值和YII值均維持在較低水平，其中YII值在72 h時(shí)和96 h時(shí)接近0，抑制效果極顯著。一年蓬水提液試驗(yàn)組銅綠微囊藻的Fv/Fm值和YII值從24 h時(shí)開始始終呈下降趨勢(shì)，96 h時(shí)抑制率分別達(dá)到95.32%和93.88%?？傮w來看，各入侵植物水提液對(duì)銅綠微囊藻光合熒光特性的抑制作用表現(xiàn)為加拿大一枝黃花>一年蓬、水葫蘆>喜旱蓮子草。

2.2.3 對(duì)水華微囊藻光合熒光特性的影響

由圖8、圖9可以看出，對(duì)照組水華微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)值始終呈現(xiàn)增加的狀態(tài)。水葫蘆水提液試驗(yàn)組的水華微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化趨勢(shì)與對(duì)照組相似，差異不顯著。喜旱蓮子草水提液試驗(yàn)組水華微囊藻的FvFm值和YII值均表現(xiàn)為先下降后增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但總體顯著低于對(duì)照組。加拿大一枝黃花試驗(yàn)組水華微囊藻的FvFm值同樣出現(xiàn)先下降后增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但YII值自24 h時(shí)至試驗(yàn)結(jié)束均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，表現(xiàn)出較高的抑制效果。一年蓬水提液對(duì)水華微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的抑制作用明顯，F(xiàn)vFm值和YII值自試驗(yàn)開始就持續(xù)降低，96 h時(shí)YII值抑制率為95.69%，抑制效果極顯著。各入侵植物水提液對(duì)水華微囊藻光合熒光特性的抑制作用表現(xiàn)為一年蓬>加拿大一枝黃花、喜旱蓮子草>水葫蘆。

3 討論

大量研究表明，很多木本植物、草本植物以及水生植物釋放出的活性物質(zhì)能夠抑制水體中藍(lán)綠藻的生長(zhǎng)[33]?；凶饔靡话憔哂羞x擇性和專一性[9]，一種化感物質(zhì)一般只對(duì)一種或幾種植物或微生物存在顯著化感作用，而對(duì)其他植物沒有影響或影響不明顯，另外由于化感物質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性，化感作用的作用機(jī)理和性能也具有多樣性[34]。

本研究表明，相比于黃絲藻，陸生入侵植物(加拿大一枝黃花、一年蓬)提取液對(duì)微囊藻生長(zhǎng)及光合系統(tǒng)有更高的抑制率，可能的原因是與黃絲藻相比，微囊藻細(xì)胞體積更小，化感物質(zhì)更容易對(duì)其產(chǎn)生影響。而黃絲藻屬于絲狀藻，存在聚集成團(tuán)的現(xiàn)象，細(xì)胞體積較大，藻細(xì)胞與化感物質(zhì)接觸面積相對(duì)較小，對(duì)植物水提液中的化感物質(zhì)響應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)。劉光濤等[4]也認(rèn)為細(xì)胞體積大小與其對(duì)化感物質(zhì)的響應(yīng)存在相關(guān)性，細(xì)胞體積越小的藻類對(duì)化感物質(zhì)的刺激反應(yīng)越敏感。

葉綠素a在光合作用中承擔(dān)著吸收和轉(zhuǎn)化光能的作用，其含量與植物光合作用密切相關(guān)[35]。研究表明，藻細(xì)胞密度對(duì)化感物質(zhì)處理的反應(yīng)與葉綠素a含量變化具有同趨勢(shì)性[36-37]。然而在本研究中，水葫蘆和一年蓬水提液在試驗(yàn)期間均能較好地抑制黃絲藻藻細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)黃絲藻光合效率影響不明顯。梁宇斌等[38]也發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的增加，銅綠微囊藻的葉綠素a含量下降，但FvFm值卻出現(xiàn)一定上升?？赡茉蚴鞘艿矫{迫時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生變化，藻體的生理狀態(tài)發(fā)生相應(yīng)的變化，但藻細(xì)胞通過自身調(diào)節(jié)生理狀態(tài)會(huì)得到一定恢復(fù)；另外，隨著化感物質(zhì)作用時(shí)間的增加，一些活性物質(zhì)失去活性，抑制效果減弱，藻細(xì)胞受到的脅迫減弱，生理活性得到一定的恢復(fù)[38]。與兩種陸生植物不同的是，喜旱蓮子草對(duì)3種水華藻生長(zhǎng)和光合系統(tǒng)都有較好的抑制作用，但對(duì)光合系統(tǒng)作用時(shí)間及強(qiáng)度不同。添加喜旱蓮子草水提液后，黃絲藻耐受強(qiáng)光能力降低，光合系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)受到一定程度的損傷，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，化感作用加劇。對(duì)于微囊藻，光合系統(tǒng)II的光能轉(zhuǎn)化效率具有一定急性抑制效應(yīng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞可以通過自我調(diào)節(jié)恢復(fù)其光合活性。可能原因是微囊藻PSII不是喜旱蓮子草所釋放的化感物質(zhì)攻擊的主要靶位點(diǎn)，而黃絲藻PSII則是主要靶位點(diǎn)[39]。

植物水提液的化感作用對(duì)不同藻類表現(xiàn)出選擇性抑藻的效果，且作用的靶位點(diǎn)不同，藻細(xì)胞密度下降并不意味著光合系統(tǒng)受到不可恢復(fù)的損傷，化感物質(zhì)如何降低葉綠素含量和破壞PSII，其途徑如何，都應(yīng)是今后研究的方向和重點(diǎn)。同時(shí)，選擇判定化感物質(zhì)抑藻效果的指標(biāo)也應(yīng)更加多樣化、全面化，對(duì)化感抑藻機(jī)理進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選取了我國(guó)幾種常見的入侵植物作為試驗(yàn)材料進(jìn)行抑藻作用的比較和篩選，以選擇高效的抑藻劑。結(jié)果表明：(1)4種常見入侵植物水提液對(duì)3種水華藻表現(xiàn)出了選擇性抑藻的作用，且主要抑制機(jī)理也不同。(2)對(duì)于黃絲藻，水葫蘆抑制藻類生長(zhǎng)的主要方式是抑制藻細(xì)胞增殖，喜旱蓮子草主要通過影響光系統(tǒng)II的活性抑制藻類生長(zhǎng)。加拿大一枝黃花和一年蓬對(duì)光合活性具有急性抑制效應(yīng)，處理48 h后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)藻細(xì)胞可通過自我調(diào)節(jié)恢復(fù)其光合活性。(3)兩種陸生入侵植物(一年蓬、加拿大一枝黃花)對(duì)銅綠微囊藻抑制效果優(yōu)于水葫蘆和喜旱蓮子草，且藻細(xì)胞數(shù)量變化與光合活性變化趨勢(shì)一致。(4)喜旱蓮子草對(duì)水華微囊藻藻細(xì)胞增殖的抑制效果更好，兩種陸生入侵植物(一年蓬、加拿大一枝黃花)對(duì)藻細(xì)胞光合活性抑制效果顯著。