張潔,毛春燕,劉利利,曾麗娜,劉紅美

(貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)工程研究中心 &生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院 生物技術(shù)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

燈盞細(xì)辛[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.]又名燈盞花，菊科飛蓬屬，屬多年生草本植物，主要分布于云南、貴州和四川等省[1]。燈盞細(xì)辛亦是貴州民間及少數(shù)民族地區(qū)常用藥材[2]，被收載于2015年版《中國(guó)藥典》[3]、《貴州中藥資源》[4]和《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[5]，具有活血通絡(luò)止痛、祛風(fēng)散寒功能，臨床上主要用于缺血性心腦血管病的治療[6-8]，同時(shí)還可用于風(fēng)濕、老年性癡呆、腎衰和糖尿病等疾病的治療[9-11]，因此藥材市場(chǎng)需求量大。由于過(guò)度采集挖掘，野生燈盞細(xì)辛已逐漸枯竭。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖快、周期短、不受外界因素限制和易管理等優(yōu)勢(shì)，是保護(hù)野生資源和解決藥材供求矛盾的有效措施[12]。目前，在燈盞細(xì)辛組織培養(yǎng)研究方面，學(xué)者們對(duì)不同外植體誘導(dǎo)效果、愈傷誘導(dǎo)影響因素以及快繁體系建立等方面進(jìn)行了研究[13-18]，但這些研究報(bào)道均為云南產(chǎn)區(qū)燈盞細(xì)辛，且在培養(yǎng)基和激素配比的種類、濃度都有所差異，貴州產(chǎn)區(qū)燈盞細(xì)辛組織培養(yǎng)快速繁殖的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。貴州省亦是燈盞細(xì)辛的重要核心產(chǎn)區(qū)之一[1，19]，且燈盞細(xì)辛藥材的有效藥用成分含量高，質(zhì)量?jī)?yōu)良[20-23]。因此，本研究通過(guò)對(duì)貴州產(chǎn)區(qū)的燈盞細(xì)辛種子進(jìn)行無(wú)菌播種、獲取無(wú)菌苗后，采用不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)燈盞細(xì)辛離體培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽形成與增殖、壯苗生根移栽等的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為貴州優(yōu)質(zhì)燈盞細(xì)辛種苗的快速繁殖提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1種子 從貴州省六盤(pán)水地區(qū)野外采集的燈盞細(xì)辛種子，由貴州醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)教研室劉紅美教授鑒定。

1.1.2主要試劑和儀器 配制 Murashige&Skoog (MS)或1/2 MS培養(yǎng)基的化學(xué)試劑：瓊脂、6-芐基腺嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)、奈乙酸(α-naphthalene acetic acid，NAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)、甘氨基、肌醇、煙酸、維生素B1、維生素B6及蔗糖均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，硝酸銨、硝酸鉀、氯化鈣、硫酸錳、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硼酸、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、乙二胺四乙酸二鈉及硫酸亞鐵均購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；LDZM-60L立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠，SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素(6-BA、NAA、IBA)，具體濃度及培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1，所有培養(yǎng)基添加3%蔗糖和0.9%瓊脂，pH 6.0～6.1，高壓滅菌條件121 ℃、25 min。培養(yǎng)條件為(25±2)℃、光照時(shí)間13 h/d，光照強(qiáng)度1 200 lx。

表1 培養(yǎng)基編號(hào)和配方Tab.1 Medium number and formulations

注：空格表示沒(méi)有加該材料。

1.2.2初代培養(yǎng) 將燈盞花種子用紗布包裹后扎好口，按常規(guī)沖洗干凈后滅菌處理；用75%乙醇浸泡0.5 min，無(wú)菌水沖洗2次，3%次氯酸鈉浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗3次，3%次氯酸鈉浸泡3 min，將種子接種到不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)以獲取無(wú)菌苗。

1.2.3葉片和葉柄愈傷組織的誘導(dǎo) 將獲得的生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗葉片切割成0.5 cm×0.5 cm，葉柄切成長(zhǎng)1 cm的小段，分別平放接種到添加不同濃度的6-BA和NAA的A1～A9培養(yǎng)基中；每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶接種3～5個(gè)外植體，重復(fù)3次；培養(yǎng)10 d后觀察愈傷組織的誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況，用“+”表示出現(xiàn)愈傷組織的體積，“+”越多表示愈傷體積越大。

1.2.4不定芽的分化與增殖 將愈傷組織誘導(dǎo)分化的叢生芽切成單株接種于添加不同濃度的6-BA和NAA的A1-A9培養(yǎng)基中，接種要求同1.2.3，培養(yǎng)20 d后對(duì)不定芽的分化增殖與生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

1.2.5生根移栽 將培養(yǎng)后高1.5～2.0 cm的無(wú)根小苗轉(zhuǎn)接到添加不同濃度的NAA和IBA的B1～B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，接種要求同1.2.3，待組織培養(yǎng)苗根系生成、并長(zhǎng)至合適長(zhǎng)度后后進(jìn)行煉苗移栽，室內(nèi)放置2 d，去封口膜，輕輕洗凈苗根部培養(yǎng)基，移栽到高溫滅菌后的泥土與珍珠巖1 ∶1混合的基質(zhì)中。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1初代培養(yǎng)獲取無(wú)菌苗

采用2次3%次氯酸鈉的滅菌方法對(duì)種子進(jìn)行滅菌，污染率為10%；接種6 d左右，種子開(kāi)始萌發(fā)，萌發(fā)率可達(dá)65%。

2.2葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)與分化

葉柄誘導(dǎo)愈傷組織結(jié)果表明A3培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)時(shí)間較短，10～15 d就出現(xiàn)愈傷組織，20 d后愈傷組織的體積較大，且新增芽點(diǎn)多，有利于下一步芽的誘導(dǎo)分化，故選擇A3培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA)為最適宜葉柄愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。見(jiàn)表2。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effect of different medium on callus inducement of E.breviscapus petiole

注：+表示出現(xiàn)愈傷組織的體積，越多表示愈傷體積越大。

10 d 20 d圖1 3號(hào)培養(yǎng)基中不同時(shí)間葉柄愈傷組織誘導(dǎo)Fig.1 The effect of No.3 medium on callus induction

2.3葉片愈傷組織的誘導(dǎo)與分化

葉片接種于培養(yǎng)基后，早期均出現(xiàn)膨大、卷曲，顏色由深綠變成淺綠；培養(yǎng)至第15天時(shí)僅A7培養(yǎng)基中葉片上出現(xiàn)較小的突起；培養(yǎng)至第20天時(shí)所有培養(yǎng)基中的葉片均逐漸發(fā)黃，A3、A4、A7、A8及A9培養(yǎng)基中出現(xiàn)較為少量的愈傷組織，結(jié)構(gòu)較為致密；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織增殖均不明顯，無(wú)芽點(diǎn)出現(xiàn)，愈傷組織和葉片逐漸出現(xiàn)黃化、褐化。因此，葉片不適合作為外植體。

2.4不定芽的增殖

將A3號(hào)培養(yǎng)基中葉柄誘導(dǎo)的帶叢生芽的愈傷切成小塊或單株接種到A1～A9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，20 d后不定芽的增殖結(jié)果表明A6培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)相對(duì)較高，可達(dá)12倍，分化出的不定芽多，且無(wú)菌苗的生長(zhǎng)狀況也較好，不定芽較粗壯，葉片大，顏色深綠，無(wú)玻璃化現(xiàn)象。故 選擇A6培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA)為最佳分化增殖培養(yǎng)基。見(jiàn)表3、圖2。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)組培苗增殖的影響Tab.3 The effects on the proliferation of tissue culture seedlings in the different mediums

注：(1)與A1比較，P<0.05；(2)與A2比較，P<0.05；(3)與A3比較，P<0.05；(4)與A4比較，P<0.05；(5)與A5比較，P<0.05；(6)與A6比較，P<0.05；(7)與A7比較，P<0.05。

圖2 6號(hào)培養(yǎng)基中增殖的燈盞細(xì)辛組培苗Fig.2 Seedlings of E.breviscapus in the sixth medium

2.5生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)20 d無(wú)根小苗轉(zhuǎn)接到B1～B5培養(yǎng)基中，10 d后觀察生根情況。結(jié)果表明，燈盞細(xì)辛接種在不添加激素的MS培養(yǎng)基中時(shí)生根率可達(dá)74.44%，但生根數(shù)目較少，根較細(xì)長(zhǎng)；降低培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度，并添加生長(zhǎng)素0.3 mg/L NAA和0.3mg/L IBA后生根率提高到89.58%，根生長(zhǎng)較為粗壯；當(dāng)NAA濃度增加到0.5 mg/L和IBA增加至0.8 mg/L時(shí)，不僅生根率達(dá)到至100%，且生根數(shù)目最多，根粗苗壯，故B5培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA)生根效果最佳，為適宜生根的培養(yǎng)基；待燈盞細(xì)辛的根生長(zhǎng)至3 cm左右時(shí)，即可進(jìn)行煉苗移栽，成活率可在85%以上。見(jiàn)表4。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)燈盞細(xì)辛無(wú)菌苗生根的影響Tab.4 The effects on the rooting of aseptic seedlings in the different mediums

3 討論

為了對(duì)保證野外采集種子的滅菌效果，同時(shí)增強(qiáng)種子對(duì)滅菌劑的耐受性，本研究采用了分開(kāi)2次2%次氯酸鈉的滅菌方法，滅菌效果較好，污染率低，同時(shí)60%的種子能夠萌發(fā)，從而有效建立無(wú)菌體系，獲取無(wú)菌苗。在植物組織培養(yǎng)快繁體系建立的過(guò)程中，激素的種類與配比對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)、器官分化、增殖、生根起著關(guān)鍵性作用[24]。在愈傷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，本研究中選用了最常用的6-BA和NAA激素，采用不同的濃度配比，對(duì)葉柄進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，結(jié)果表明的細(xì)胞分裂素6-BA為1.0 mg/L時(shí)，出現(xiàn)愈傷時(shí)間較早，體積也較大，其中又以與0.3 mg/L的生長(zhǎng)素NAA的搭配效果最好，出現(xiàn)的芽點(diǎn)較多，非常有利于后期的分化增殖和植株再生。故篩選出的最適愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。另一方面，不同外植體在植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)愈傷的反應(yīng)能力是有差異的[25]。實(shí)驗(yàn)中以燈盞細(xì)辛的葉片作為外植體時(shí)，愈傷誘導(dǎo)反應(yīng)不佳，并出現(xiàn)褐化、黃化現(xiàn)象，故在該試驗(yàn)條件下，葉柄比葉片更適合做為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，這與劉成洪等[16]研究結(jié)果一致。

細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)不定芽的增殖和分化有著較強(qiáng)的促進(jìn)作用，但濃度過(guò)高時(shí)往往會(huì)增加再生芽畸形、玻璃化的概率[26-27]。本實(shí)驗(yàn)中NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，芽的增殖倍數(shù)明顯增高，當(dāng)6-BA升至3.0 mg/L時(shí)，分化的芽增多，增殖倍數(shù)最高可達(dá)13倍，但苗較細(xì)弱、容易出現(xiàn)玻璃化。因此，6-BA的適宜濃度為2.0 mg/L。同時(shí)，適量的生長(zhǎng)素配合6-BA使用，不僅能夠促進(jìn)植株的生長(zhǎng)也能提高芽的增殖與分化能力[28]。實(shí)驗(yàn)中6-BA為2.0 mg/L時(shí)，搭配0.3 mg/L的NAA，增殖倍數(shù)可達(dá)到12倍，無(wú)菌苗生長(zhǎng)狀態(tài)也良好，故此為分化增殖最適宜的濃度搭配。

生根實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，燈盞細(xì)辛組培苗的生根較為容易，在不添加激素的情況下，生根率就可達(dá)74.44%，只是根數(shù)目較少，根不夠粗壯，不利于移栽。實(shí)驗(yàn)中，采用降低培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度的1/2 MS培養(yǎng)基和添加生長(zhǎng)素NAA和IBA，均有利于提高生根率和生根質(zhì)量。隨著NAA和IBA的濃度升高，都能夠使生根率和生根數(shù)目隨之增高，NAA濃度為0.5 mg/L、IBA為0.8 mg/L時(shí)，獲得最佳生根效果，這與吳毅歆等[17]采用的激素配比結(jié)果一致。生根效果好的組培苗非常有利于提高后期的煉苗移栽的存活率，同時(shí)移栽初期也要注意蓋塑料薄膜保濕，移栽后成活率在85%以上，可用于種植推廣。

綜上所述，本研究建立了適宜于貴州產(chǎn)區(qū)的燈盞細(xì)辛的組培快繁體系，從葉柄外植體誘到再生苗移栽大約只需要50～60 d，和常規(guī)人工栽培育苗需要80～90 d的周期相比，大大縮短了育苗周期，有利于快速、高效、低成本的為人工栽培提供大量品質(zhì)優(yōu)良的種苗，對(duì)于發(fā)展和推廣貴州燈盞細(xì)辛中藥材的規(guī)模化種植具有重要意義。