楊亞平,段素琴,楊鳳梅,李艷艷,劉權(quán),劉雨,趙遠(yuǎn),馬紹輝,和占龍
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 &北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南 昆明 650118)
手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一類由人腸道病毒(human enterovirus,HEV)感染引起的流行性傳染病,多發(fā)生于5歲以下嬰幼兒,可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和心肺衰竭等癥狀[1-2],2008年5月HFMD被納入我國法定報告的丙類傳染病[3]。近年來,HFMD引起的病例呈高發(fā)態(tài)勢,嚴(yán)重危害嬰幼兒健康和生命安全,給家庭帶來沉重的疾病和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。目前,我國對HFMD的監(jiān)測主要集中在腸道病毒71型(enterovirus A71,EVA71)、柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16,CVA16)、柯薩奇病毒A組10型(coxsackievirus A10,CVA10)和柯薩奇病毒A組6型(coxsackievirus A6,CVA6),對其他腸道病毒的分型鑒定尚不多,但近年來其他腸道病毒比例有所升高[5];此外,引起HFMD的病原譜構(gòu)成呈多樣化和復(fù)雜化[6]??滤_奇病毒B組2型(coxsackievirus B2,CVB2)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬B組[7]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,CVB2是引起兒童HFMD的病原體之一[8],CVB2還會引起心肌炎和無菌性腦膜炎[9-10],嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官感染[11],尤其是病毒性心肌炎常見的原因[12-13]。目前,對于病毒性心肌炎的臨床診斷,主要依據(jù)臨床癥狀、生化檢查和心電圖[14-15],但由于病毒性心肌炎發(fā)病初期癥狀不典型,出現(xiàn)臨床癥狀時往往已經(jīng)累及心肌,引起心肌不可逆轉(zhuǎn)的損傷,嚴(yán)重危害健康[16]。由于目前有關(guān)CVB2檢測方法的報道甚少,為了加強(qiáng)對CVB2引起的HFMD的監(jiān)測及預(yù)防,因此本研究擬建立檢測CVB2的SYBR Green I逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,為CVB2的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供快捷、有效的分子檢測手段。
1.1材料
1.1.1病毒 CVB2(RW41-2/YN/CHN/2012)、CVA6及CVA10病毒由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室馬紹輝課題組惠贈。
1.1.2主要試劑和儀器 JM109感受態(tài)細(xì)胞、pMDTM19-T Vector Cloning 、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、AxyPrep DNA Gel Recovery Kit、in vitro Transcription T7 Kit、One Step TB Green?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit及DNA A-Tailing Kit 均購自大連寶生物工程有限公司,TIANpure Midi Plasmid Kit購自天根生物有限公司,C1000型 PCR 儀、C1000 TouchTM Thermal Cycler實(shí)時熒光定量PCR儀及凝膠成像自動分析儀均購自美國BIO-RAD公司。
1.2方法
1.2.1引物設(shè)計與合成 利用GenBank中CVB2毒株(RW41-2/YN/CHN/2012)的病毒衣殼蛋白1(virus protein 1,VP1)基因序列,通過MEGA7.0軟件對本毒株和GenBank中其他CVB2基因序列比對,之后利用Primer5.0軟件設(shè)計引物(表1) ,由上海生工生物工程(股份)公司合成。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequence
1.2.2制備標(biāo)準(zhǔn)品 用Trizol法提取病毒RNA,采用RT-PCR擴(kuò)增的方法,用PCR引物VP1-F和VP1-R特異性擴(kuò)增875 bp的CVB2 DNA片段;用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit純化PCR產(chǎn)物,利用DNA A-Tailing試劑盒和pMDTM19-T Vector Cloning試劑盒對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端加A與載體連接,形成T-A連接產(chǎn)物;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞,用藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選重組質(zhì)粒,挑取白色菌落轉(zhuǎn)接至含有氨芐的LB培養(yǎng)液中,37 ℃、200 r/min。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,切下含有目的片段的3 572 bp瓊脂糖凝膠,用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit純化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,體外轉(zhuǎn)錄用In vitro Transcription T7 Kit體外轉(zhuǎn)錄獲得模板RNA。于室溫下采用20 μL體系:10×緩沖液2 μL,腺嘌呤核糖核苷三磷酸(adenine ribonucleoside triphosphate,ATP)、鳥嘌呤核糖核苷三磷酸(guanine ribonucleoside triphosphate,GTP)、胞嘧啶核糖核苷三磷酸(cytosine ribonucleoside triphosphate,CTP)及尿嘧啶核糖核苷三磷酸(uracil ribonucleoside triphosphate,UTP)各2 μL,T7 RNA Polymerase 0.5 μL,核酸酶抑制劑2 μL,線性化質(zhì)粒50 ng,去離子水補(bǔ)足至20 μL,37 ℃、3 h,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加RNase free DNase I(1 U/L)0.2 L,37 ℃、30 min,用苯酚/氯仿抽提、異丙醇沉淀轉(zhuǎn)錄RNA,采用紫外分光光度計測定RNA濃度,計算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)[17]。
1.2.3RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及檢測方法評價 (1)優(yōu)化反應(yīng)體系,在相同模板量與反應(yīng)體系中,采用矩陣法優(yōu)化引物濃度,即以無引物二聚體產(chǎn)生、背景噪音小、熒光信號強(qiáng)等為判斷標(biāo)準(zhǔn),確定引物的最佳濃度;(2)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以10倍梯度稀釋CVB2病毒VP1重組質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)品,取濃度102~109拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液8個梯度,進(jìn)行SYBR Green I RT-PCR反應(yīng),同時設(shè)立陰性對照,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線;(3)特異性檢測,利用優(yōu)化的SYBR Green I RT-PCR檢測體系對CVB2、CVA6、CVA10、CVA16及EV71的病毒核酸進(jìn)行檢測,評價方法的特異性;(4)靈敏性檢測,將CVB2的標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋(100~109拷貝/μL),使用建立的SYBR Green I RT- PCR方法進(jìn)行檢測,評價其對病毒核酸檢測的靈敏性;(5)重復(fù)性檢測,分別制備不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(103、106及109拷貝/μL),同時進(jìn)行SYBR Green I RT-PCR,每個標(biāo)準(zhǔn)品做3個重復(fù),觀察組內(nèi)重復(fù)性;對上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別做獨(dú)立的SYBR Green I RT-PCR檢測,同樣做3個重復(fù),觀察組間重復(fù)性。
1.3統(tǒng)計學(xué)分析
2.1CVB2特異性片段VP1的擴(kuò)增
CVB2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,700~1 000 bp見一條特異性條帶,大小與預(yù)期一致,見圖1A;重組質(zhì)粒pMD19-T-CVB2經(jīng)Xbal酶切后,3 572 bp出現(xiàn)一條清晰的條帶,與預(yù)期相符,見圖1B;用測定的重組質(zhì)粒序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的CVB2株(RW41-2/YN/CHN/2012)的基因序列進(jìn)行序列比對,同源性為99.77%。
注:A為CVB2的VP1片段,B為酶切后的重組質(zhì)粒;M表示DNA marker ,1~3表示3個重組質(zhì)粒。圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳及重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of RT-PCR products and recombinant plasmids after enzyme
2.2反應(yīng)體系優(yōu)化
經(jīng)矩陣法優(yōu)化后最佳引物終濃度為300 μmol/L,SYBR Green I RT-PCR反應(yīng)體系及各試劑使用量為:2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 10 μL、TaKaRa Ex Taq HS Mix 1.2 μL、PrimeScript PLUS RTase Mix 0.4 μL、RNase free dH2O 5.2 μL、q-RT-PCR-F/R(10 μmol/L)各0.6 μL、模板2 μL。反應(yīng)條件為42 ℃、5 min,95 ℃、10 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,共40次循環(huán)。
2.3檢測方法的評價
2.3.2特異性評價 該方法檢測CVB2為陽性,CVA6、CVA10、CVA16及EV71無熒光擴(kuò)增曲線,提示該方法特異性較強(qiáng),見圖2D。
注:A為擴(kuò)增曲線,B為熔解曲線,C為標(biāo)準(zhǔn)曲線,D為特異性檢測。圖2 SYBR Green I RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和特異性檢測Fig.2 Establishment and specific detection of SYBR Green I RT-PCR standard curve
2.3.3靈敏性評價 該方法檢測標(biāo)準(zhǔn)品在102~109拷貝/μL時,可出現(xiàn)較好的擴(kuò)增曲線,建立的SYBR Green I RT-PCR方法的最低檢測限為102拷貝/μL。
2.3.4重復(fù)性評價 對不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(103、106及109拷貝/μL)各進(jìn)行3次組間和組內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示組內(nèi)及組間CV均<1%,見表2。
表2 SYBR Green I RT-PCR重復(fù)試驗(yàn)Tab.2 Repeated test results of SYBR Green I RT-PCR
近年來CVB2病毒感染引起手足口病的報道逐漸增多,建立一種簡單快速、特異性強(qiáng)及靈敏性高的檢測方法對于手足口病病原的檢測和分型有重要意義[18]。HFMD相關(guān)病原體的檢測方法有病毒分離和血清學(xué)診斷,前者是診斷病毒性疾病的金標(biāo)準(zhǔn),但檢測周期較長,敏感性較低;后者雖快速,但操作繁瑣,費(fèi)時費(fèi)力且易出現(xiàn)假陽性、假陰性的問題[19]。目前,HFMD病原體常用檢測技術(shù)有RT-PCR、實(shí)時熒光PCR探針法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)和基于毛細(xì)管電泳芯片的激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)[20-23]。但這些方法需用昂貴的熒光探針或需要引物和復(fù)雜的設(shè)備,而SYBR Green I 染料法不需要熒光探針,并且設(shè)備簡單[24]。SYBR Green I 染料法中的染料與雙鏈DNA結(jié)合后使熒光增強(qiáng)1 000倍左右,并能對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連續(xù)的檢測,通過溶解曲線判斷引物是否有特異性,通過熔解溫度有效區(qū)分特異性產(chǎn)物、非特異性產(chǎn)物及引物二聚體[25]。同時,該方法檢測樣品簡便快捷,無需凝膠電泳且可實(shí)時觀察結(jié)果,大大節(jié)省了時間[26]。呂莉琨等[27]應(yīng)用該方法對柯薩奇病毒A組的3個基因型進(jìn)行了分型鑒定。當(dāng)然SYBR Green I RT-PCR檢測方法自身也有不足之處:如無法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小,因各實(shí)驗(yàn)室所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不一致,可能會使結(jié)果缺乏可比性等,隨著對檢測方法的進(jìn)一步優(yōu)化,這些問題都將能得到改進(jìn)[28]。
本研究以CVB2的保守基因片段作為RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備的模板,以保證實(shí)驗(yàn)檢測的準(zhǔn)確性。在擴(kuò)增合成VP1標(biāo)準(zhǔn)品RNA的DNA模板時,在用以擴(kuò)增VP1的上游引物的5′端加了T7啟動子,之后在體外對重組質(zhì)粒的VP1片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。該方法從技術(shù)上避免了用載體合成RNA的缺點(diǎn),同時利用試劑盒體外轉(zhuǎn)錄的RNA,可以避免交叉污染,減少生物安全風(fēng)險。本研究構(gòu)建的含有T7啟動子的CVB2的重組質(zhì)粒,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、精制獲得的RNA用做標(biāo)準(zhǔn)品,將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系獲得的熔解曲線單一,曲線平穩(wěn)且無非特異性溶解峰,可對CVB2實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增。同時,利用標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線在102~109拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,最低檢測限度 102拷貝/μL,R2為0.996,擴(kuò)增效率 102.2%;對EVA7、CVA16、CVA10和CVA6均無交叉反應(yīng),組間和組內(nèi)的CV均小于1%。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)建立的檢測CVB2的SYBR Green I RT-PCR方法具有良好的靈敏性、特異性和重復(fù)性,可用于CVB2毒的快速檢測和定量分析。