黃小龍，翟立升，閆慧清

(1. 貴州師范大學(xué) 貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；2. 貴州師范大學(xué) 國(guó)家林業(yè)局西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；3. 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550001)

【研究意義】植物甾醇在自然界中廣泛存在，是以環(huán)戊烴全氫菲為骨架的三萜類化合物，有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式，主要分布在植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中[1]。植物甾醇在食品、醫(yī)學(xué)和動(dòng)物中的研究表明，其具有抑制腫瘤、降低血液膽固醇、抗菌消炎、調(diào)劑免疫和抗衰老的作用，應(yīng)用前景十分廣闊[2-6]。植物甾醇與動(dòng)物甾醇的區(qū)別是C-24位置多了額外的烷基，這個(gè)過程由甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶(SMTs)完成[7]，SMTs是植物甾醇代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶[8]，但其在水稻中的功能還有待更深入的研究。【前人研究進(jìn)展】到目前為止，植物中大量的SMT基因被分離克隆，如菠菜[9]、大豆[10]和擬南芥[11]等。有研究表明，SMT基因在植物響應(yīng)逆境脅迫的過程中發(fā)揮重要作用[12]。在高鹽脅迫下，大豆中總甾醇含量較未脅迫的降低50 %，谷甾醇含量沒有變化，但是飽和脂肪酸的含量大量增加，說明在植物中甾醇含量的穩(wěn)定對(duì)于抵抗高鹽脅迫引起的傷害有重要作用[13]。在植物中乙基甾醇有利于增強(qiáng)細(xì)胞膜的內(nèi)聚力，在面對(duì)高溫和低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的甲基甾醇大量轉(zhuǎn)化成乙基甾醇，從而調(diào)節(jié)植物體的溫度變化以適應(yīng)高溫和低溫脅迫[14]。植物甾醇除了響應(yīng)非生物脅迫外，還響應(yīng)細(xì)菌性病原體引起的生物脅迫，在擬南芥中沉默鯊烯合酶、甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶2、C-22甾醇去飽和酶基因，加強(qiáng)擬南芥細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的外排，促進(jìn)細(xì)菌性病原體的生長(zhǎng)；在擬南芥超表達(dá)C-22甾醇去飽和酶基因的植株中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的外排受到抑制，表明擬南芥通過調(diào)控甾醇含量的變化控制細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的外排，響應(yīng)細(xì)菌引起的免疫應(yīng)答[15]。【本研究切入點(diǎn)】甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶在植物中的作用十分重要，干擾OsSMT1的表達(dá)使得水稻具有矮化和抗旱的表型[16]，OsSMT2已經(jīng)被克隆，但目前研究?jī)H知道其參與了植物甾醇的生物合成[7]，并不清楚其分子作用機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，擬通過生物信息學(xué)分析的方法研究水稻OsSMT2基因的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)模式，為該基因的進(jìn)一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

檢索OsSMT2的相關(guān)文獻(xiàn)資料，以O(shè)sSMT2在RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的MSU Locus號(hào)(LOC_Os03g04340)為線索，下載該基因的相關(guān)序列進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 水稻OsSMT2基因的序列比對(duì)分析 通過RGAP數(shù)據(jù)庫(kù)下載OsSMT2基因的基因組序列、CDS序列和氨基酸序列，利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blast工具，將水稻OsSMT2基因的氨基酸序列與GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取水稻(Oryzasativa)、藥用野生稻(Oryzabrachyantha)、粟(Setariaitalica)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)、大麥(Hordeumvulgare)、鳳梨(Ananascomosus)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminata)等10種不同植物的SMT2蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析，尋找STM2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。選取多個(gè)物種的SMT2氨基酸序列，利用MEGA-X軟件進(jìn)行同源性分析，并通過鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 水稻OsSMT2蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析 通過Protparam (https://web.expasy.org/protparam/)所提供的蛋白質(zhì)序列分析工具，對(duì)OsSMT2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(分子量、理論pI、正負(fù)電荷殘基總數(shù)及半衰期等)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。利用ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)OsSMT2蛋白質(zhì)的疏水性/親水性，SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)OsSMT2蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)OsSMT2蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。通過SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)工具 (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析OsSMT2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，利用在線網(wǎng)站GOR4 (https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)對(duì)OsSMT2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)同源建模網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsSMT2蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 水稻OsSMT2基因順式調(diào)控元件的分析 在水稻RAP-DB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中，獲取水稻OsSMT2基因起始密碼子上游2kb區(qū)域的核苷酸序列作為OsSMT2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，利用PlantCARE植物順式調(diào)控元件分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，對(duì)OsSMT2基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析。

1.2.4 水稻OsSMT2基因共表達(dá)基因的GO 富集和KEGG富集分析 通過RED數(shù)據(jù)庫(kù)(http://expression.ic4r.org/co-search)中的共表達(dá)工具，設(shè)置PCC(Pearson correlation coefficient)為0.7，獲得OsSMT2基因的共表達(dá)基因。然后通過David網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)和Kobas網(wǎng)站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)對(duì)這些基因進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析。

1.2.5 水稻OsSMT2基因的表達(dá)模式分析 通過CREP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://crep.ncpgr.cn/)下載水稻OsSMT2基因在Minghui 63中的芯片數(shù)據(jù)，研究OsSMT2基因在水稻不同組織中的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsSMT2蛋白的性質(zhì)

水稻OsSMT2基因的基因組序列全長(zhǎng)為1875 bp，無內(nèi)含子，CDS全長(zhǎng)1092 bp，編碼363個(gè)氨基酸。OsSMT2蛋白質(zhì)分子量40 618.61，理論pI為8.19，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為41，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為43，分子式C1822H2828N508O514S17，總原子數(shù)5689，脂肪酸指數(shù)為82.20，預(yù)計(jì)半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為28.51，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。OsSMT2蛋白的親水性水平平均為-0.176，是親水性蛋白(圖1A)。信號(hào)肽S值在1～32位氨基酸之間，其中最大值在第26個(gè)氨基酸；預(yù)測(cè)值是0.797，平均分值為0.371(小于閾值0.5)，說明該蛋白不含有信號(hào)肽(圖1B)。該蛋白在第6和第24個(gè)氨基酸之間存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1C)。磷酸化位點(diǎn)有31個(gè)，包括Ser16個(gè)、Thr8個(gè)和Tyr7個(gè)(圖1D)。

A.OsSMT2蛋白的親水性分析; B.OsSMT2蛋白的信號(hào)肽分析; C.OsSMT2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè); D.OsSMT2蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析A.Hydrophilic analysis of OsSMT2; B.Signal peptide analysis of OsSMT2; C.Transmembrane domain prediction of OsSMT2; D.Phosphorylation sites prediction of OsSMT2圖1 OsSMT2蛋白的性質(zhì)分析 Fig.1 Analysis of the properties of OsSMT2

h為α螺旋，e為延伸鏈，c為無規(guī)則卷曲h: Alpha helix; e: Extended strand; c: Random coil圖2 OsSMT2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Secondary structure prediction of OsSMT2

圖3 水稻OsSMT2(A)和砷(III)S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(B)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of OsSMT2 (A) and As(III) S-adenosylmethionine methyltransferase (B)

2.2 水稻OsSMT2蛋白的結(jié)構(gòu)

2.2.1 二級(jí)結(jié)構(gòu) 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，OsSMT2蛋白有3種二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α螺旋有132個(gè)氨基酸殘基參與，占36.36 %；延伸鏈有76個(gè)氨基酸殘基參與，占20.94 %；無規(guī)則卷曲有155個(gè)氨基酸殘基參與，占42.70 %(圖2)。

2.2.2 三級(jí)結(jié)構(gòu) 從圖3看出，水稻OsSMT2蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。

圖4 不同物種中OsSMT2的同源蛋白比對(duì)Fig.4 Homologous alignment of OsSMT2 in different species

圖5 不同物種中SMT2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Conserved domains of SMT2 in different species

圖6 OsSMT2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of OsSMT2

圖7 OsSMT2在水稻Minghui 63 中的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)Fig.7 Genechip expression data of OsSMT2 in Minghui 63

2.3 水稻OsSMT2蛋白的同源性

OsSMT2蛋白具有甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，位于OsSMT2蛋白質(zhì)第107～283位氨基酸，還含有甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域，位于OsSMT2蛋白質(zhì)的第295～360位氨基酸(圖4)。通過MEME網(wǎng)站預(yù)測(cè)這些蛋白的保守基序發(fā)現(xiàn)，共有10個(gè)保守基序，其中Motif 1～9在10個(gè)物種中都含有，可見這9個(gè)基序?yàn)镾MT2蛋白的核心基序(圖5)。

2.4 OsSMT2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹和表達(dá)譜

從圖6看出，水稻中OsSMT2與藥用野生稻的ObSMT2親緣關(guān)系最近，與小米、高粱、玉米、大麥等主要糧食作物中SMT2的親緣關(guān)系較近。水稻OsSMT2基因在吸水后72 h種子中的表達(dá)量最高，在胚根、胚芽和小花中表達(dá)量相對(duì)較高，在葉中表達(dá)量最低(圖7)。表明，OsSMT2基因在水稻生長(zhǎng)起始階段有重要的功能。

2.5 水稻OsSMT2基因啟動(dòng)子元件

在水稻OsSMT2基因啟動(dòng)子區(qū)域，除存在RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)TATA-box、CAAT-box等基本調(diào)控元件外，還存在脅迫誘導(dǎo)元件、激素響應(yīng)元件和光誘導(dǎo)元件(表1)。從OsSMT2基因啟動(dòng)子區(qū)域具有的順式作用元件種類和數(shù)量推測(cè)，OsSMT2基因的表達(dá)模式受光和激素的誘導(dǎo)。啟動(dòng)子中還存在4種脅迫響應(yīng)元件，表明，OsSMT2基因可能與植物的脅迫響應(yīng)有關(guān)。

2.6 OsSMT2基因共表達(dá)基因的GO富集和KEGG富集

共表達(dá)基因GO主要富集在微管、微管運(yùn)動(dòng)活性、基于微管的運(yùn)動(dòng)、驅(qū)動(dòng)蛋白復(fù)合物、ATP結(jié)合、ATP酶活性、染色質(zhì)結(jié)合、有絲分裂染色體濃縮、胞質(zhì)分裂、微管細(xì)胞骨架組織中(圖8A)。KEGG富集9個(gè)代謝通路，包括DNA復(fù)制、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、類固醇生物合成、吞噬、嘧啶代謝、內(nèi)吞作用、嘌呤代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和代謝途徑等代謝通路中(圖8B)。

表1 OsSMT2的啟動(dòng)子元件Table 1 Promoter elements of OsSMT2

橫坐標(biāo)表示富集到的基因數(shù)，A為 GO富集，B為 KEGG富集The abscissa indicates the number of genes enriched, A, GO enrichment, B, KEGG enrichment圖8 水稻OsSMT2基因共表達(dá)基因的富集Fig.8 Enrichment of co-expressed genes of OsSMT2

3 討 論

3.1 OsSMT2基因的功能相對(duì)保守

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)一般包含α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲，相鄰氨基酸殘基在氫鍵的作用下形成不同的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)具有不同的活性和功能。因此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)對(duì)推測(cè)其功能具有重要參考價(jià)值。水稻OsSMT2基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，有42.70 %的氨基酸殘基參與。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上發(fā)生折疊，使蛋白質(zhì)具有更復(fù)雜的生物活性，并且能夠執(zhí)行生物催化功能。對(duì)OsSMT2蛋白進(jìn)行同源建模時(shí)發(fā)現(xiàn)，OsSMT2蛋白結(jié)構(gòu)同樣以無規(guī)則卷曲為主，表明水稻OsSMT2蛋白中132個(gè)氨基酸殘基參與的α螺旋可能是起主要功能的區(qū)域。

水稻OsSMT2基因的功能結(jié)構(gòu)域在不同物種中保守性較高，Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 6、Motif 7、Motif 9處在甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域中，是2種結(jié)構(gòu)域的核心基序，SMT2基因在不同植物中的核心保守基序相同。因此，不同植物中SMT2基因的功能十分相似，水稻OsSMT2基因的研究結(jié)果也可為其他物種提供參考。水稻OsSMT2基因在主要糧食作物中同玉米、小麥、高粱的親緣關(guān)系最近，同大麥的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，表明水稻OsSMT2基因的功能預(yù)測(cè)可以為玉米、小麥、高粱等糧食作物SMT2基因的研究提供參考。

3.2 OsSMT2基因參與水稻的抗寒和耐旱

在OsSMT2基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在多種響應(yīng)元件，包括激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件。這些元件很可能會(huì)影響OsSMT2基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而影響水稻中甾醇的含量以應(yīng)對(duì)不同的外界脅迫。在大豆中，當(dāng)環(huán)境溫度較低時(shí)，植物總甾醇的含量會(huì)降低，豆甾醇和β-谷甾醇的比值升高，當(dāng)溫度升高時(shí)，大豆中植物總甾醇的水平會(huì)升高，其中油菜甾醇所占的比例與溫度變化成正相關(guān)，并且豆甾醇和β-谷甾醇的比例下降[17]。水稻OsSMT2基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在LTR元件參與低溫響應(yīng)，因此低溫條件可能會(huì)影響水稻中OsSMT2基因的表達(dá)，進(jìn)而影響水稻中甾醇的含量以抵抗低溫脅迫。同樣，在水稻OsSMT2基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在MBS元件，該元件可以參與干旱誘導(dǎo)，推測(cè)OsSMT2基因可能響應(yīng)干旱脅迫，因?yàn)楫?dāng)植物遇到干旱脅迫時(shí)，植物甾醇的分子結(jié)構(gòu)使得其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，這種細(xì)胞膜性質(zhì)的改變就可以抑制植物葉片中水分的流失，使植物在干旱條件下也能夠生存[18]。黃瓜在低氧脅迫下，甾醇合成途徑的產(chǎn)物-油菜素內(nèi)酯可以促進(jìn)黃瓜中糖類由葉片向根部的轉(zhuǎn)運(yùn)，并提高黃瓜根部糖酵解代謝酶的活性[19]。水稻OsSMT2基因啟動(dòng)子區(qū)域存在GC-motif 和ARE兩種厭氧誘導(dǎo)元件，因此OsSMT2基因可能會(huì)響應(yīng)低氧脅迫。綜上所述，推測(cè)OsSMT2基因可能響應(yīng)水稻低溫、干旱和低氧脅迫，可作為水稻抗寒和耐旱育種方面的候選基因。

3.3 OsSMT2基因影響水稻種子萌發(fā)

擬南芥AtSMT2-1基因在煙草中超表達(dá)后，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草中24-甲基甾醇的含量降低，抑制了細(xì)胞分裂，影響生長(zhǎng)發(fā)育[20]。水稻OsSMT2基因共表達(dá)基因的GO富集和KEGG富集分析顯示，這些基因主要參與DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂的主要過程，如DNA復(fù)制的起始、DNA解旋酶的活性、細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生等過程。OsSMT2基因表達(dá)模式分析顯示該基因在水稻種子萌發(fā)時(shí)的表達(dá)量最高，因此推測(cè)水稻OsSMT2基因可能影響水稻萌發(fā)過程中的細(xì)胞分裂，進(jìn)而影響水稻的種子萌發(fā)率。

4 結(jié) 論

通過對(duì)水稻OsSMT2基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，水稻OsSMT2基因具有甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶C末端結(jié)構(gòu)域，參與水稻中甾醇的生物合成。該基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有低溫和干旱脅迫響應(yīng)元件，因此OsSMT2基因可能參與水稻的非生物脅迫響應(yīng)。共表達(dá)基因的富集分析顯示，該基因可能參與DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的主要過程。OsSMT2基因的表達(dá)模式分析表明，OsSMT2基因在吸水后72 h種子中的表達(dá)量最高，OsSMT2可能會(huì)影響水稻種子萌發(fā)和植物發(fā)育。研究結(jié)果為水稻的抗逆改良和種子萌發(fā)提供了理論參考和候選基因。