孟巧巧，岳海燕，張玉琴，馬丹煒

(四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610101)

【研究意義】桉樹為桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)的總稱，原產(chǎn)于澳大利亞、印度尼西亞島嶼和馬布亞新幾里亞，共有945個種和變種[1]，具有生長快、適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高等特性[2]，與楊樹(Populus)、松樹(Pinus)并稱為三大速生造林樹種[3]，具有蓄水保土、固碳釋氧、積累營養(yǎng)物質(zhì)、凈化環(huán)境等生態(tài)功能[4]，被世界各地大規(guī)模引種栽培[5]?！厩叭搜芯窟M展】桉樹引入我國已經(jīng)有120多年的歷史，目前我國的桉樹人工林主要分布在長江以南地區(qū)[4]，種植面積超過460萬hm2，僅次于巴西[6]。桉樹葉富含揮發(fā)油，但不同種類和不同地區(qū)桉樹的揮發(fā)油成分和含量差異較大[7]。桉樹揮發(fā)油中含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[8-9]、抗菌[10-12]、抗病毒[13-14]、驅(qū)蟲[15-17]等活性，對糖尿病也具有一定的療效[8]。近年來，有關(guān)桉樹揮發(fā)油抗腫瘤活性的研究逐漸成為熱點[18-23]，如托里桉(E.torelliana)[20]、本沁桉(E.benthamii)[21]、檸檬桉(E.citriodora)[22]、赤桉(E.camaldulensis)[23]等植物的揮發(fā)油均具有一定的抗腫瘤活性，但這些研究僅涉及桉屬900多種的少數(shù)種類。桉屬植物是成都市園林綠化中主要的行道樹樹種，有關(guān)成都地區(qū)桉屬次生代謝物質(zhì)抗腫瘤活性的研究較少?！颈狙芯康那腥朦c】本研究采用水蒸氣蒸餾法提取了成都地區(qū)的藍桉(E.globulus)、巨桉(E.grandis)和大葉桉(E.robusta)葉的揮發(fā)油，運用GS-MS技術(shù)進行成分分析，歸一化法測定了各成分相對含量；分別以人正常肝L02細胞和人肝癌SMMC-7721細胞為受試細胞株，采用MTT法初步評價了3種桉樹葉揮發(fā)油的抗腫瘤活性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在為成都地區(qū)桉屬資源的綜合利用和挖掘其藥用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藍桉、巨桉、大葉桉的葉于2016年12月采集于四川師范大學成龍校區(qū)和獅子山校區(qū)及其附近街道；人正常肝L02細胞和人肝癌SMMC-7721細胞源自四川大學華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室。

1.2 研究方法

1.2.1 揮發(fā)油的制備 分別將3種桉樹葉陰干后剪成小段，準確稱取1000 g，水蒸氣蒸餾法提取4 h，得到淡黃色透明并具有芳香性氣味的揮發(fā)油，無水Na2SO4除去水分，稱重，得油率以干重計；用0.22 μm微孔濾膜過濾后用于GC-MS分析。

1.2.2 揮發(fā)油成分的GS-MS分析 采用 Aglient 7890A/ 5975c氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別測定3種桉樹揮發(fā)油的成分和相對含量。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5ms(規(guī)格為60 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管色譜柱；恒流模式，載氣為99.999 %氦氣，流量為1.0 mL·min-1；升溫程序為起始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃·min-1升至200 ℃，再以20 ℃·min-1升至280 ℃，保持2 min；進樣口溫度為250 ℃；采用20︰1分流比進樣，進樣體積為1 μl。

質(zhì)譜條件：采用單四極桿質(zhì)譜檢測器，電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，氣相色譜質(zhì)譜接口溫度為250 ℃；溶劑延遲10 min，全掃描模式。揮發(fā)性成分經(jīng)質(zhì)譜掃描后，在Agilent Chemstation化學工作站得到總離子流量圖，經(jīng)NIST標準譜庫檢索，從特征離子及相對豐度等方面進行比較，確定各色譜峰對應(yīng)的化學成分。用峰面積歸一法對各化合物進行定量，計算出各組分的相對含量。

1.2.3 抗腫瘤活性的測定 用含10 %新生牛血清、1 %青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)L02細胞和SMMC-7721細胞，37 ℃、5 %CO2、飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。采用MTT法測定3種揮發(fā)油對2種細胞的抑制率及半抑制濃度(IC50值)。具體方法是取對數(shù)生長期細胞分別消化、離心，培養(yǎng)液重懸制成細胞懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)，每孔100 μl，1×105個/mL接種于96孔板，放于CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，細胞貼壁后進行處理。處理組加入經(jīng)DMSO稀釋為不同濃度的揮發(fā)油2 μl，每孔補加98 μl RPMI-1640培養(yǎng)液，使揮發(fā)油的最終濃度分別為3.13，6.25，12.50，25.00和50.00 μg·mL-1，且設(shè)置陰性對照和溶劑對照(1 %DMSO)，每處理6次重復(fù)。培養(yǎng)24 h后，20 μl MTT溶液(用PBS配制成濃度為5 mg·mL-1，過濾除菌后，置于-20 ℃冰箱避光保存)作用4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，置于多功能酶標儀(MD/Spectra Max M2)內(nèi)振蕩5 min，490 nm下測吸光值(OD值)。

細胞增殖抑制率(%) =(1-OD處理組/OD溶劑對照)×100 %

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0進行ANOVA方差分析，Duncan法進行多重比較，Probit法分析IC50值，采用Microsoft Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 成都3種桉樹揮發(fā)油的GC-MS分析鑒定

用水蒸氣蒸餾法提取的藍桉、巨桉和大葉桉揮發(fā)油的質(zhì)量濃度分別為912.22、945.71和836.67 mg·mL-1，揮發(fā)油得率分別為3.67 %、1.21 %和0.43 %；藍桉葉揮發(fā)油分離出39個色譜峰(圖1)，共鑒定出34種化合物，占總離子峰的96.14 %；巨桉葉揮發(fā)油分離出42個色譜峰(圖2)，共鑒定出34種化合物，占總離子峰的93.95 %；大葉桉揮發(fā)油分離出42個色譜峰(圖3)，共鑒定出31種化合物，占總離子峰的86.76 %。

3種桉樹葉的揮發(fā)油成分和相對含量結(jié)果見表1。藍桉葉揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯(17.18 %)、檸檬烯(4.65 %)、桉油精(59.55 %)、鄰傘花烴(4.40 %)等，占揮發(fā)油總量的85.78 %；巨桉葉揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯(17.89 %)、檸檬烯(4.38 %)、桉油精(50.49 %)、鄰傘花烴(6.71 %)等，占揮發(fā)油總量的79.47 %；大葉桉揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯(41.91 %)、檸檬烯(5.28 %)、桉油精(7.68 %)、松香芹醇(12.49 %)等，占揮發(fā)油總量的67.36 %；3種揮發(fā)油有17種共有成分，即α-蒎烯、二環(huán)庚烷7,7-二甲基-2-亞甲基、莰烯、檸檬烯、桉油精、葑醇、龍腦烯醛、松香芹醇、龍腦、異松蒎酮、4-萜烯醇、反式-1(7)，8-孟二烯-2-醇、香芹酮、別香橙烯、石竹烯、鄰傘花烴和蘋果香精。在共有成分中，含量最高的成分為α-蒎烯和桉油精。在藍桉、巨桉、大葉桉的揮發(fā)油中，α-蒎烯的相對含量分別為17.18 %、17.89 %、41.91 %，桉油精相對含量分別為59.55 %、50.49 %、7.68 %；3種桉樹揮發(fā)油的成分和含量差異較大，藍桉和巨桉葉揮發(fā)油中含量最高的成分是桉油精，分別占59.55 %和50.49 %，而大葉桉揮發(fā)油中含量最高的成分為α-蒎烯(41.91 %)。

2.2 成都地區(qū)3種桉樹揮發(fā)油體外抗腫瘤活性

MTT試驗結(jié)果表明，3種桉樹揮發(fā)油對L02細胞和SMMC-7721細胞的增殖均有不同程度的抑制作用(圖4)，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)。用揮發(fā)油處理24 h時，藍桉、巨桉和大葉桉的揮發(fā)油對L02細胞的IC50分別為21.29、9.40和5.08 μg·mL-1，對SMMC-7721細胞的IC50分別為13.53、7.36和4.66 μg·mL-1。3種揮發(fā)油對2種細胞的抑制效應(yīng)從大到小依次為大葉桉、巨桉和藍桉，SMMC-7721細胞對揮發(fā)油的敏感性大于L02細胞。由此可見，成都地區(qū)3種桉樹揮發(fā)油具有抗腫瘤活性，且對人正常細胞的抑制效應(yīng)小于腫瘤細胞。

圖1 成都地區(qū)藍桉葉揮發(fā)油GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from the leaves of Eucalyptus globulus in Chengdu

圖2 巨桉葉揮發(fā)油GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of the essential oil from the leaves of Eucalyptus grandis in Chengdu

圖3 大葉桉葉揮發(fā)油GC-MS總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of the essential oil from the leaves of Eucalyptus robusta in Chengdu

表1 成都地區(qū)3種桉樹葉揮發(fā)油的化學組成Table 1 Chemical component of the essential oils from three Eucalyptus species leaves in Chengdu

續(xù)表1 Continued table 1

3 討論與小結(jié)

3.1 成都地區(qū)3種桉樹葉揮發(fā)油成分的差異

Sebei,et al.[24]研究表明，在同一地區(qū)桉屬不同種類中，揮發(fā)油的成分和含量差異較大。本研究供試的3種桉樹葉中，揮發(fā)油得率最高的是藍桉(3.67 %)，其次是巨桉(1.21 %)，含量最少的是大葉桉(0.43 %)。從藍桉的揮發(fā)油中檢出34種化合物，其中相對含量大于1 %的成分為7種，占揮發(fā)油總量的90.07 %；從巨桉揮發(fā)油中檢出的34種化合物，相對含量大于1 %的成分為9種，占揮發(fā)油總量的89.93 %；從大葉桉揮發(fā)油中檢出31種化合物，相對含量在1 %以上的成分有9種，占揮發(fā)油總量的79.88 %；α-蒎烯、莰烯、右旋檸檬烯、桉油精、葑醇、龍腦烯醛、龍腦、香芹酮、別香橙烯、石竹烯、鄰傘花烴等共17種化合物是3種揮發(fā)油的共有成分。在這些共有成分中，含量最高的成分均為α-蒎烯和桉油精，但含量明顯差異，在藍桉、巨桉和大葉桉的葉揮發(fā)油中，α-蒎烯的含量分別為17.18 %、17.89 %和41.91 %，桉油精的含量分別為59.55 %、50.49 % 和7.68 %。

不同小寫字母表示P<0.05的顯著水平圖4 3種桉樹葉揮發(fā)油對SMMC-7721細胞和L02細胞增殖的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of three Eucalyptus essential oils on cell proliferation of SMMC-7721 cell and L02 cells

另一方面，分布在不同地區(qū)的同種桉樹的揮發(fā)油成分及其相對含量也具有較大的差異。云南省蒼山區(qū)的藍桉揮發(fā)油主要成分為桉油精(72.71 %)、α-松油醇(2.54 %)、α-蒎烯(9.22 %)、藍桉醇(2.77 %)、乙酸松油酯(3.10 %)和香樹烯(2.47 %)[25]；突尼斯市的藍桉揮發(fā)油主要成分為桉油精(48.20 %)、α-蒎烯(16.10 %)、γ-萜品烯(8.90 %)和對傘花烴(8.80 %)[10]；巴西的藍桉揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯(4.63 %)、對傘花烴(5.35 %)、檸檬烯(6.38 %)和桉油精(83.65 %)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，成都地區(qū)的藍桉揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯(17.18 %)、檸檬烯(4.65 %)、桉油精(59.55 %)、松香芹醇(2.10 %)、愈創(chuàng)木烯(1.00 %)、桉油醇(1.19 %)和鄰傘花烴(4.40 %)，比較不同地區(qū)藍桉的揮發(fā)油成分的含量可見，藍桉葉揮發(fā)油中含量最高的成分均為桉油精；阿根廷的巨桉葉揮發(fā)油主要成分是α-蒎烯(52.71 %)、鄰傘花烴(9.70 %)、桉油精(18.38 %)和龍腦(2.95 %)等[27]，本研究結(jié)果表明，成都地區(qū)巨桉葉揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯(17.89 %)、檸檬烯(4.38 %)、桉油精(50.49 %)、鄰傘花烴(6.71 %)和龍腦(3.24 %)，阿根廷和成都地區(qū)的巨桉葉的揮發(fā)油中含量最高的成分均為α-蒎烯；巴西大葉桉揮發(fā)油主要成分是α-蒎烯(73.00 %)、β-蒎烯(6.80 %)、月桂烯(0.80 %)、水芹烯(2.30 %)、檸檬烯(8.30 %)、異松油烯(1.60 %)和藍桉醇(1.30 %)等[28]，本研究結(jié)果表明，成都市大葉桉揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯(41.91 %)、月桂烯(1.18 %)、藍桉醇(0.13 %)和檸檬烯(5.28 %)等，不同地區(qū)的大葉桉揮發(fā)油含量最高的均是α-蒎烯。

3.2 成都地區(qū)3種桉樹葉揮發(fā)油體外抗腫瘤活性

前人研究表明，桉樹揮發(fā)油具有抑制腫瘤細胞增殖的效應(yīng)，如托里桉(E.torelliana)[20]、本沁桉(E.benthamii)[21]、檸檬桉(E.citriodora)[22]、赤桉(E.camaldulensis)[23]等的揮發(fā)油均具有體內(nèi)和體外抗腫瘤活性。本研究結(jié)果表明，成都地區(qū)的藍桉、巨桉和大葉桉葉揮發(fā)油對人肝癌SMMC-7721細胞均具有抑制效應(yīng)，其IC50分別為13.53、7.36 和4.66 μg·mL-1，以大葉桉揮發(fā)油的抗腫瘤活性最佳。因此，桉屬植物葉的揮發(fā)油普遍具有抗腫瘤活性，具有較大的開發(fā)潛力。

本沁桉葉揮發(fā)油的抗腫瘤活性大于其單體成分α-蒎烯、4-萜烯醇和γ-萜品烯的抗腫瘤活性[20]，推測其原因是揮發(fā)油的各成分之間存在著協(xié)同作用，主要成分的活性可以被其他微量成分調(diào)節(jié)，從而使揮發(fā)油發(fā)揮更好的抗腫瘤活性[29]。Newman et al.[17]的研究表明，桉油精具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的效應(yīng)，本研究的3種桉樹揮發(fā)油的主要成分均是α-蒎烯和桉油精，本研究室將在后續(xù)研究中進一步分析3種桉樹葉揮發(fā)油主要成分的抗腫瘤活性以及不同成分之間的協(xié)同效應(yīng)。