謝鈺珍，覃鴻妮，張 勇，趙文瑋

(1. 蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院, 江蘇 蘇州 215123；2. 金唯智生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215123)

【研究意義】基因組DNA作為真核生物最重要的遺傳物質(zhì)，決定人的相貌身高特征以及疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此，生命體遺傳信息的快速獲得對(duì)于生命科學(xué)的研究十分重要。DNA測(cè)序法是檢測(cè)基因序列的最可靠方法。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序最關(guān)鍵的因素就是模板質(zhì)量。但PCR 產(chǎn)物中往往存在多余的引物和dNTP，這些小核苷酸片段的存在會(huì)使測(cè)序的底峰特別高，嚴(yán)重影響測(cè)序結(jié)果[1-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】核酸外切酶I(Exonuclease I, Exo1)是一種單鏈的核酸外切酶，能夠按照3'→5’的方向水解單鏈DNA，釋放5'-單核苷酸并保持末端 5'-二核苷酸完整[4]。因其可降解 PCR 混合物中的所有單鏈 DNA，所以在涉及測(cè)序或標(biāo)記方法應(yīng)用的 PCR 產(chǎn)物制備中極為有用。【本研究切入點(diǎn)】目前，由于表達(dá)量低、提純步驟繁瑣、得率低等因素的制約，商品化的核酸外切酶價(jià)格居高不下。而國(guó)內(nèi)外研究中所使用的Exo1主要從各商業(yè)公司購(gòu)置，對(duì)于開(kāi)展大量測(cè)序工作的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，科研成本昂貴?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)重疊PCR技術(shù)體外合成sbcB基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，通過(guò)條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)該酶的異源大量表達(dá)，通過(guò)消化單鏈DNA和雙鏈DNA驗(yàn)證其活性，旨在設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單、高效和低成本的核酸外切酶I制備方法，為更多核酸酶的實(shí)驗(yàn)室制備提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 目的基因 sbcB基因編碼的是核酸外切酶I，基因總長(zhǎng)度為1428 bp，序列如圖1。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒 載體質(zhì)粒pET-30a，感受態(tài)細(xì)胞E.coliTop10，E.coliBL21(DE3)購(gòu)自Novagen公司，T 7 expressionE.coli由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的合成 ①重疊PCR合成sbcB基因:根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)了42條引物，委托金唯智生物科技有限公司完成合成。將引物稀釋到10 pmol/μl，每條引物取3 μl混勻作為引物混液(mix)，通過(guò)2輪PCR擴(kuò)增出目的基因。PCR擴(kuò)增體系及程序見(jiàn)表1。②PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與回收:吸取50 μl的二輪PCR產(chǎn)物點(diǎn)入濃度為1.5 %的回收膠，電泳儀220 V，280 mA電泳20 min?；厥债a(chǎn)物即所得目的基因。

圖1 sbcB基因序列Fig.1 The sequence of sbcB gene

表1 PCR體系和PCR程序Table 1 PCR system and PCR procedure

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 ①將質(zhì)粒pET30a用NdeI 和KpnI酶切，酶切體系見(jiàn)表2；酶切體系配好后，37 ℃水浴鍋反應(yīng)30 min。瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。②將酶切后的表達(dá)載體pET-30a與sbcB基因進(jìn)行連接，構(gòu)建重組載體pET-30a-sbcB。連接體系見(jiàn)表3。PCR儀50 ℃連接60 min后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。

表2 酶切反應(yīng)體系Table 2 Enzyme digestion system

1.2.3 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定 挑取24個(gè)單克隆37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，利用菌落PCR擴(kuò)增目的基因(菌檢體系及程序見(jiàn)表4)，電泳檢測(cè)到目的條帶的克隆送測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 重組反應(yīng)體系(20 μl)Table 3 Recombination reaction system(20 μl)

表4 菌檢PCR反應(yīng)體系及程序Table 4 Reaction system and procedure of Colony PCR

1.2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)及純化 將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，菌液涂布于含kan抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。選取多個(gè)重組菌落接種LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)2 h。離心，收集菌體。將誘導(dǎo)后的菌體重懸于lysisbuffer，超聲破碎后離心去沉淀，收集樣品液。蛋白純化機(jī)純化蛋白。10 %聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定表達(dá)產(chǎn)物，檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的分子量及純化效果。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的功能驗(yàn)證 以S1核酸外切酶為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，分別用該酶和表達(dá)產(chǎn)物EXO1酶消化僅含單鏈DNA的樣本(stap-tri-ssDNA)和單雙鏈混合的DNA樣本(DSG-SSDNA)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)消化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的合成

因目的基因總長(zhǎng)1428 bp，為了提高合成成功率，分兩段進(jìn)行合成。目的基因的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，sbcb(1～22)和sbcb(21～42)的理論值分別為785和791 bp。從圖上可看出擴(kuò)增的條帶大小均在750～1000 bp之間，與預(yù)期理論值基本相符，可判斷目的基因擴(kuò)增成功。

1～4為sbcb(1～22)重復(fù)樣；5～8為sbcb(21～42)重復(fù)樣，M為DNA 5000 Marker1-4: Amplification of sbcB(1-22);5-8: Amplification of sbcB(21-42);M:DNA 5000 Marker圖2 sbcB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of sbcB gene

圖3 重組表達(dá)載體菌落Fig.3 Bacterial colony of pET-30a-sbcB

2.2 重組質(zhì)粒載體pET-30a-sbcB的篩選與鑒定

2.2.1 LB固體培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)情況 經(jīng)隔夜培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出了菌落，菌落白色圓潤(rùn)無(wú)其他雜菌(圖3)，挑選出單斑進(jìn)行菌檢PCR。

2.2.2 菌落PCR電泳圖 菌檢時(shí)使用的引物為T7和T7T，這是一對(duì)在載體pet30a與目的產(chǎn)物連接處附近最恰當(dāng)?shù)囊?，菌檢出的目的條帶的大小應(yīng)為1674 bp。從電泳圖上可以看出，大部分克隆的大小在1500～2000 bp之間，與理論值相符(圖4)。隨機(jī)挑取4個(gè)大小相符的克隆測(cè)序，結(jié)果與目的基因序列一致，陽(yáng)性克隆篩選成功。

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

重組pET-30a-sbcB質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中以胞內(nèi)可溶性形式高效表達(dá)。超聲破菌后，經(jīng)親和柱層析，15 %SDS-PAGE鑒定顯示目的蛋白。從圖5可以看出，表達(dá)產(chǎn)物在54.5 KD處呈現(xiàn)清晰的蛋白帶，分子量大小與預(yù)期結(jié)果一致，蛋白純化成功。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的功能驗(yàn)證

2.4.1 消化單鏈DNA樣本(stap-tri-ssDNA) stap-tri-ssDNA大小為350 bp左右。從圖6看出，陽(yáng)性對(duì)照(Line4)條帶正常，說(shuō)明樣品沒(méi)問(wèn)題。Line2和Line3 350 bp處均無(wú)條帶，說(shuō)明EXO1和S1一樣，能去除單鏈。且由Line1和Line2的對(duì)比可顯示出，EXO1對(duì)于單鏈的去除有非常重要的作用，有FastAP無(wú)EXO1，則無(wú)法去除單鏈。

圖4 菌落PCR產(chǎn)物Fig.4 Colony PCR products

M：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；1：BL21(DE3)/pET-30a-sbcB 的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物M：Low molecular protein marker；1：Induced expression of BL21(DE3)/pET-30a-sbcB圖5 重組表達(dá)載體pET-30a-sbcB誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of induced recombinant pET-30a-sbcB

Line1為只加FastAP、未加EXO1消化后條帶；Line2為有FastAP和EXO1存在下的消化后條帶；Line3為S1消化后條帶；Line4為未加任何酶消化的stap-tri-ssDNA條帶Line1: The result of the functioning of FastAP without EXO1;Line2: The result of the functioning of FastAP with EXO1;Line3: The result of the functioning of Exonucleases S1;Line4: Blank control圖6 S1核酸外切酶和EXO1分別消化stap-tri-ssDNA結(jié)果圖Fig.6 Digestion products of stap-tri-ssDNA

2.4.2 消化單雙鏈DNA混合樣本(DSG-SSDNA) DSG-SSDNA樣品中既有單鏈又含有雙鏈，雙鏈條帶大小理論值為594 bp，單鏈條帶大小理論值為400 bp。由圖7可以看出，陽(yáng)性對(duì)照Line3明顯有兩條帶，大小與理論值相符，說(shuō)明樣品及加樣操作無(wú)問(wèn)題。Line1和Line2只有1條帶，大小594 bp左右，說(shuō)明樣品中的單鏈均被消化掉了。證明表達(dá)產(chǎn)物EXO1和S1核酸外切酶一樣，可消化單鏈，但并不會(huì)消化雙鏈。

3 結(jié)論與討論

核酸外切酶是一類能從多核苷酸鏈的一端開(kāi)始按序催化水解3’-5’-磷酸二酯鍵，降解核苷酸的酶，其水解的最終產(chǎn)物是單個(gè)核苷酸。按作用的特性差異可將其分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶。核酸外切酶I(Exonuclease 1, EXO1)屬于單鏈的核酸外切酶，能夠從單鏈DNA(ssDNA)的3’-OH到5’-P末端逐個(gè)催化水解堿基對(duì)之間的磷酸二酯鍵，釋放5'-單核苷酸并保持末端 5'-二核苷酸的完整。EXO1除了參與DNA復(fù)制、DNA錯(cuò)配修復(fù)(MMR)以及DNA雙鏈斷裂修復(fù)等過(guò)程外，還與肝癌、肺癌、卵巢早衰等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。

近年來(lái)，隨著基因組學(xué)研究的深入，測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅猛[8]。PCR產(chǎn)物作為常見(jiàn)的測(cè)序模板，其質(zhì)量直接影響測(cè)序結(jié)果。有研究證實(shí)，純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)序的成功率及測(cè)序質(zhì)量明顯高于非純化的PCR產(chǎn)物。因此，要得到理想的測(cè)序結(jié)果，必須在測(cè)序前對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，以清除PCR反應(yīng)中殘留的dNTPs、引物和鹽離子。因核酸外切酶 I 可降解原PCR反應(yīng)中殘存的的單鏈引物和任何在PCR中產(chǎn)生的外來(lái)單鏈DNA。蝦堿性磷酸酶(SAP)可去除PCR混合物中殘留的dNTPs，SAP-EXO1純化法成為了測(cè)序前PCR產(chǎn)物處理的常用方法之一[9]?？v觀國(guó)內(nèi)外研究，實(shí)驗(yàn)用EXO1大多購(gòu)自商業(yè)公司，雖然該法操作簡(jiǎn)單、快捷，昂貴的EXO1一定程度上限制了其應(yīng)用。若能自行合成，并高效表達(dá)目的蛋白，可極大程度的降低科研成本。

Line1為EXO1酶消化后的條帶；Line2為S1核酸外切酶消化后的條帶；Line3是空白對(duì)照，為未加任何酶消化的DSG-SSDNA條帶；Line4為MarkerLine1: The result of the functioning of EXO1;Line2: The result of the functioning of Exonucleases S1;Line3: Blank control;Line4: Marker圖7 S1核酸外切酶和EXO1酶分別消化DSG-SSDNA結(jié)果圖Fig.7 Digestion products of DSG-SSDNA

sbcB基因，一種大腸桿菌中的核酸外切酶I，天然存在于E.colik-12中。由于生長(zhǎng)環(huán)境及其他因素的影響，目的蛋白表達(dá)嚴(yán)重受限，表達(dá)量低。大腸桿菌T7噬箘體有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。T7噬箘體基因1編碼的T7 RNA聚合酶選擇性的激活T7噬箘體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。它是一種高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍，并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。在細(xì)胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘體啟動(dòng)子的情況下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)T7噬箘體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬箘體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄能達(dá)到很高的水平[10-11]。因此本研究首先用重疊PCR技術(shù)體外人工合成sbcB基因，成功構(gòu)建重組載體sbcB-pET-30a后再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)中，誘導(dǎo)表達(dá)并獲得目的蛋白。因BL21(DE3)大腸桿菌的染色體中已經(jīng)被整合了編碼T7RNA聚合酶的基因，并且位于LacUV5啟動(dòng)子的下游，所以在質(zhì)粒轉(zhuǎn)入后，T7RNA能夠特異性識(shí)別T7啟動(dòng)子，開(kāi)啟下游基因的轉(zhuǎn)錄，最終實(shí)現(xiàn)了目的蛋白(EXO1)的高效表達(dá)。后續(xù)的功能驗(yàn)證也證實(shí)：EXO1可消化單鏈且不會(huì)消化雙鏈，能夠適用于實(shí)驗(yàn)室中測(cè)序前PCR產(chǎn)物的處理，并且在單鏈DNA QC時(shí)或許可以代替S1核酸外切酶。事實(shí)上EXOI酶的功能遠(yuǎn)不止這些，該酶的成功表達(dá)為后續(xù)更深入的功能研究奠定了良好基礎(chǔ)，也為其他核酸酶的發(fā)現(xiàn)與成功克隆提供了一定的參考價(jià)值。