李可，呂可欣，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

水稻是我國主要的糧食作物，約占全國糧食總產(chǎn)量的1/3[1]。水稻屬喜弱酸性的作物，適宜的pH值為6～7，根系正常生長的適宜pH 值為4.5～5.5，偏酸性的土壤對水稻秧苗的生長極為有利[2]。可能與酸性條件可活化土壤中某些營養(yǎng)元素，消減有害物質(zhì)積累，提高秧苗生理機(jī)能及增強(qiáng)抗逆性有關(guān)[3]。

床土調(diào)酸目的是創(chuàng)造一個適宜的酸性土壤環(huán)境，提高水稻種子萌發(fā)的生理機(jī)能及土壤中磷鐵等營養(yǎng)元素的有效性和根系吸收能力，抑制立枯病菌的繁殖，一定程度上決定了育苗的成敗。目前常用的調(diào)酸方法有兩種，一種是采用鈣鎂磷肥、石灰氮等化學(xué)調(diào)酸劑，另一種是用98%的濃硫酸直接調(diào)酸[4-5]。傳統(tǒng)土壤調(diào)酸的方式雖然有效但是不好掌握用量，容易造成殘留污染。木醋液有效成分主要是有機(jī)酸，經(jīng)過一定倍數(shù)稀釋后可替代化學(xué)調(diào)酸劑用于水稻育秧苗床土調(diào)酸[2]。而大量微生物在代謝過程中可以產(chǎn)生有機(jī)酸[6-7]，由此可見，生物調(diào)酸可以作為一種更新化學(xué)調(diào)酸的手段。

芽孢桿菌（Bacillus spp．）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要微生物資源，常用的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B．a(chǎn)myloliquefaciens）、多粘類芽孢桿菌（B．polymyxa）、蠟樣芽孢桿菌（B．cereus）、巨大芽孢桿菌（B．megaterium）、短小芽孢桿菌（B．pumilus）等[8-12]。而目前有關(guān)芽孢桿菌產(chǎn)酸方面鮮被提及，因此，篩選具有產(chǎn)酸能力的芽孢桿菌意義重大。

種子的萌發(fā)是種子從吸水到胚根突破種皮期間所發(fā)生的一系列生理生化變化的過程[13]。種子組織中存在超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等抗逆酶，能夠在種子萌發(fā)過程中清除代謝產(chǎn)生的活性氧，保護(hù)種子膜結(jié)構(gòu)在發(fā)芽期間的完整性[14]。丙二醛（MDA）含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映植物胞膜受傷害的程度[15]。種子萌發(fā)過程中抗逆酶活性的增加有利于防御病菌入侵，有效的降低了種子萌發(fā)過程中病害的發(fā)生[16]。

試驗(yàn)通過選擇培養(yǎng)基分離，獲得產(chǎn)酸芽孢桿菌，利用產(chǎn)酸芽孢桿菌發(fā)酵液對水稻種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，以探究不同濃度產(chǎn)酸芽孢桿菌發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)的影響，從而為產(chǎn)酸芽孢桿菌在水稻生產(chǎn)中的具體應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為水稻生物調(diào)酸提供新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻種子：龍粳18，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻研究室提供。

分離培養(yǎng)基：酵母膏10 g，碳酸鈣10 g，蔗糖10 g，無水乙醇30 mL，瓊脂粉18 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蔗糖10 g，無水乙醇30 mL，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)酸芽孢菌株的分離與純化

將供試土壤樣品用無菌水10倍稀釋后，置于80℃恒溫水浴鍋中處理30 min，然后將處理液10倍等比稀釋，選取10-5的土壤稀釋液在分離培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布法分離。分離后的培養(yǎng)皿倒置于30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d。挑取鈣溶解圈較大的單個純菌落轉(zhuǎn)移到斜面試管中培養(yǎng)。

1.2.2 產(chǎn)酸菌株的鑒定

采用顯微觀察、生理生化指標(biāo)測定與16S rDNA測序技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行產(chǎn)酸菌株鑒定。

具體生理生化指標(biāo)選擇根據(jù)《芽孢桿菌屬（Bacillus）二分檢索表》中的相應(yīng)指標(biāo)，對待測菌株進(jìn)行檢驗(yàn)[17]。

將待測菌株在液體中培養(yǎng)24 h，采用CTAB/Na－Cl裂解法提取菌液DNA，選擇通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，并對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。具體方法如下：

CTAB/NaCl裂解法提取菌液DNA：將產(chǎn)酸菌單菌落培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，放置于30℃搖床中振蕩培養(yǎng) 24 h，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 110 r·min-1。取 1.0 mL 培養(yǎng)后的菌液加入1.5 mL離心管中，13 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心2 min后去除上清；沉淀重懸于1.0 mL 0.85%的NaCl溶液中，13 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心2 min后去除上清；沉淀重懸于550 μL 1×TE中，加入濃度為 35 mg·mL 的溶菌酶 17 μL，37 ℃下溫育 30 min；加濃度為20 mg·mL的蛋白酶K3 μL，37℃下溫育30 min；加 30 μL的 10%SDS溶液，37℃下溫育30 min；加 100 μL 5 M NaCl溶液充分混勻；加 80 μL CTAB/NaCl溶液，混勻后在65℃下水浴10 min；加等體積氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕振蕩混勻后在13 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液加入到新的1.5 mL的離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）振蕩混勻，12 000 r·min-1離心 5 min，保留上清；加入0.48 mL異丙醇，輕輕震蕩混合至DNA沉淀產(chǎn)生，12 000 r·min-1離心15 min，收集DNA沉淀，用1 mL 75%乙醇于12 000 r·min-1離心5 min洗滌DNA沉淀，真空干燥0.5 h。將最終得到的DNA沉淀溶解于 50 μL 1×TE 中。

PCR 反應(yīng)體系為 50 μL：10×PCR Buffer 5 μL；MgCl 4 μL；dNTP 1 μL；模板 DNA 2 μL；引物 27F/1492R 各 4 μL；Taq DNA 酶 2 μL；ddH2O 補(bǔ)足到 50 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；50℃退火1 min；72℃延伸1.5 min，循環(huán)擴(kuò)增25次；72℃下溫育5 min；4℃保存。

1.2.3 產(chǎn)酸菌發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)的影響

選取籽粒飽滿的水稻種子，共設(shè)置8個處理，每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)100粒種子。具體處理設(shè)置為產(chǎn)酸芽孢桿菌發(fā)酵液與清水按 0∶1，1∶50，1∶40，1∶30，1∶20，1∶10，1∶0 比例稀釋，同時設(shè)置一個培養(yǎng)基的對照，進(jìn)行水稻種子萌發(fā)試驗(yàn)。

萌發(fā)試驗(yàn)處理方法為：利用不同處理的液體分別浸種24 h后，將種子擺放于含有相同液體潤濕的濾紙上，置于無菌培養(yǎng)皿中，覆蓋相同處理潤濕的濾紙保濕，蓋上皿蓋。3 d后檢測種子發(fā)芽率及測定種子萌發(fā)過程中的生理指標(biāo)變化。采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，氮藍(lán)四唑光化還原法測定SOD活性，紫外吸收法測定CAT活性，愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性[18-19]。

樣品粗酶提取液制備：稱0.5 g樣品放入研缽中，倒入少量石英砂，在冰浴條件下進(jìn)行研磨，待樣品磨成粉末狀后，加入pH為7.8的磷酸緩沖液5 mL繼續(xù)研磨，后將研磨物全部倒入10 mL離心管中，4℃下4 000 r·min-1離心20 min，取上清液即為粗酶液，置于4℃下備用。

MDA含量測定：取1 mL粗酶液加入2 mL MDA反應(yīng)液，封口后沸水浴15 min，冷卻后離心，取上清在OD600、OD532、OD450三個波長下比色，每組三個重復(fù)?？瞻滓? mL蒸餾水代替粗酶液，其余處理與試驗(yàn)組一致。MDA含量單位為μmol·g-1，含量計(jì)算公式：

MDA 濃度 C（μmol·L-1）=6.45（OD532-OD600）-0.56 OD450；MDA 含量（μmol·g-1）=C×V/W

式中V為提取液體積，W為樣品鮮重。

SOD酶活性測定：各組分別取粗酶液200 μL，加入3 mL SOD反應(yīng)液后置于4 000 Lux光照強(qiáng)度下，反應(yīng)30 min后在OD560下進(jìn)行比色，每組三個重復(fù)?？瞻诪?00 μL pH為7.8的磷酸緩沖液加入3 mL SOD反應(yīng)液，嚴(yán)格避光保存30 min。酶活單位為鮮重酶單位每克（U·gFW-1），計(jì)算公式：

SOD總活性＝[（Ack-AE）×V]/（1/2Ack×W×Vt）

Ack為照光對照管的吸光度，AE為樣品管的吸光度，V為樣品液總體積，Vt為測定時的酶液用量，W為樣品鮮重。

CAT酶活性測定：取200 μL粗酶液加入2.5 mL CAT反應(yīng)液，立即放于OD240下比色，每隔一分鐘讀數(shù)一次，共計(jì)五分鐘。以每分鐘變化OD值為酶活單位，每組三次重復(fù)?？瞻讓φ諡?00 μL pH為7.8的磷酸緩沖液中加入2.5 mL CAT反應(yīng)液。以每分鐘OD 值降低 0.01 為單位酶活（U·（g·min）-1），計(jì)算公式：

CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）

ΔA240為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，W為樣品鮮重，t為反應(yīng)時間（min），Vt為提取酶液總體積，Vs為測定時取用酶液體積。

POD酶活性測定：取200 μL酶液加入3 mL POD反應(yīng)液，立即置于分光光度計(jì)中在OD470下比色，每隔一分鐘讀數(shù)一次，共計(jì)五分鐘。以每分鐘酶活變化OD值為酶活單位，每組3次重復(fù)?？瞻诪?00 μL pH為7.8的磷酸緩沖液中加入3 mL POD反應(yīng)液。以每分鐘 OD 值升高 0.01為單位酶活（U·（g·min）-1），計(jì)算公式：

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）

ΔA470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，W為樣品鮮重，t為反應(yīng)時間，Vt為提取酶液總體積，Vs為測定時取用酶液體積。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel表格和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸菌株的分離

培養(yǎng)2 d后，在平板上出現(xiàn)大量菌落，從具有水解圈并生長旺盛的單菌落中分離選取12株，記錄從菌落邊緣至透明水解圈邊緣的距離（表1）。通過對比發(fā)現(xiàn)：2號菌落的透明水解圈最大，為5.5 mm，將其命名為BY-2073。在分離培養(yǎng)基上，該菌落呈油脂狀，米白色，表面平滑，邊緣整齊，培養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)生色素（圖 1）。

表1 12株產(chǎn)酸芽孢桿菌菌落透明水解圈大小（mm）Table 1 Transparent ring size of 12 colonies of Bacillus strains of lactic acid hydrolysis（mm）

圖1 產(chǎn)酸芽孢桿菌by-2073菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of acid-producing bacillus

2.2 產(chǎn)酸菌株的鑒定

純化后生長2 d的菌體經(jīng)簡單染色后在顯微鏡油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：菌體形態(tài)多為短桿狀，有芽孢，單個或成對、成鏈排列（圖2）。革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果為革蘭氏陽性菌，芽孢小于1 μm，位于菌體一端且菌體沒有膨大（圖3，圖4）。

圖2 簡單染色Fig.2 Simple stain

圖3 革蘭氏染色Fig.3 Gram stain

圖4 芽孢染色Fig.4 Spore stain

根據(jù)二分檢索表，對該菌株的形態(tài)學(xué)及其生理生化特征進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株符合短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的主要特征（表 2）；16S rDNA 分子鑒定表明：該菌株DNA的PCR產(chǎn)物片段長度約為1 500 bp，送檢測序結(jié)果經(jīng)Genbank比對并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），確定待測菌株BY-2073也為短小芽孢桿菌，故結(jié)合形態(tài)與生理生化指標(biāo)及分子生物學(xué)鑒定，初步確定該菌株為短小芽孢桿菌。

圖5 待測菌株BY-2073的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the tested strain BY-2073

表2 待測菌株BY-2073二分檢索鑒定結(jié)果Table 2 Binary search evaluation test of the tested strain BY-2073

2.3 短小芽孢桿菌BY-2073菌株發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)的影響

2.3.1 發(fā)酵液處理對水稻種子萌發(fā)率的影響

由圖6可以看出，水稻種子經(jīng)過不同濃度產(chǎn)酸菌發(fā)酵液處理，除1∶0發(fā)酵液稀釋液處理的種子幾乎沒有萌發(fā)跡象外，不同濃度產(chǎn)酸菌發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)率均有促生作用，種子萌發(fā)率均在92%左右。

圖6 不同處理對水稻種子萌發(fā)率的影響Fig.6 Effect of different treatments on rice seed germination rate

2.3.2 發(fā)酵液處理對水稻種子萌發(fā)中MDA含量的影響

圖7表明，經(jīng)不同濃度發(fā)酵液處理后的水稻種子MDA含量不同，除1∶20和1∶10發(fā)酵液稀釋液之外，其他處理與對照相比，MDA含量均有降低。其中，1∶30發(fā)酵液稀釋液處理的水稻種子MDA含量最低，達(dá)到2.747 Umol·g-1，與清水對照相比降低了43.30%。

圖7 不同處理對MDA含量的影響Fig.7 Effect of different treatments on MDA contents

2.3.3 發(fā)酵液處理對水稻種子萌發(fā)中SOD活性的影響

圖8表明，經(jīng)不同濃度發(fā)酵液處理后的水稻種子SOD酶活性不同，各濃度發(fā)酵液稀釋液對水稻種子SOD酶活性均有促進(jìn)作用，1∶30發(fā)酵液稀釋液處理的水稻種子SOD酶活活性達(dá)到最高，為63.713 U·g-1，與清水對照相比提高了124.37%。

圖8 不同處理對SOD酶活性影響Fig.8 Effect of different treatments on SOD enzyme activity

2.3.4 發(fā)酵液處理對水稻種子萌發(fā)中CAT活性的影響

從圖9可以看出，經(jīng)不同濃度發(fā)酵液處理的水稻種子CAT活性不同，除1∶0發(fā)酵液稀釋液外，其余處理水稻種子CAT活性均低于清水對照，1∶30發(fā)酵液稀釋液處理的水稻種子CAT活性為191.667 U，與清水對照相比提高了24.32%。

圖9 不同處理對CAT酶活性影響Fig.9 Effect of different treatments on CAT enzyme activity

2.3.5產(chǎn)酸菌發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)時POD活性的影響

從圖10可以看出，經(jīng)過不同濃度發(fā)酵液稀釋液處理的水稻種子POD酶活性均較高，1∶40發(fā)酵液稀釋液處理的水稻種子POD酶活性為14 416.667 U，與清水對照相比提高了33.13%。

圖10 不同處理對POD酶活性的影響Fig.10 Effect of different treatments on POD enzyme activity

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌是一類重要的根際促生細(xì)菌，由于其能產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽抱、對環(huán)境和人畜安全等特性而被廣泛地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，謝珊珊[20]的試驗(yàn)驗(yàn)證枯草芽抱桿菌OKB105能夠明顯促進(jìn)水稻株高的生長，促生效果為25.2%。陳劉軍等[21]發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌AR156能抑制水稻紋枯病菌的生長，直接降低病害傳播的可能性，能增強(qiáng)水稻保護(hù)性酶SOD，CAT和POD酶活性，增加水稻對紋枯病的抵抗力。Chauhan等[22]通過田間試驗(yàn)，分別用內(nèi)生芽孢桿菌TSH42和蠟狀芽孢桿菌TSH7進(jìn)行細(xì)菌化的姜黃植株和聯(lián)合使用對姜黃有促生作用并且提高了姜黃的產(chǎn)量。Qiao J等[23]通過試驗(yàn)明確枯草芽孢桿菌PTS-394能夠促進(jìn)番茄植株生長，并且能夠有效抑制土壤傳播疾病。王勇等[24]采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選出解淀粉芽孢桿菌GZ-5的最適生長條件，并通過盆栽試驗(yàn)確定其對番茄具有促進(jìn)生長的作用。何碧珀等[25]采用浸種法試驗(yàn)，得到解淀粉芽孢桿菌B10-26發(fā)酵液對芝麻種子的萌發(fā)率及芝麻幼苗的根長、株高和鮮、干質(zhì)量都有顯著促進(jìn)作用。金美芳等[26]將多粘類芽孢桿菌S960對番茄灌根使用后，番茄葉綠素A、植株地上生物量、根系生物量、株高、莖周長均顯著升高，而枯萎高度占株高比例顯著降低，因此，多粘類芽孢桿菌S960能促進(jìn)番茄植株生長且對其枯萎病有一定的防治效果。林玲等[27]從馬來西亞植物根際土壤中分離得到具有抑制水稻白葉枯病菌和油菜菌核病菌的芽孢桿菌，分別有解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。

短小芽孢桿菌在植物病害防治、微生態(tài)制劑等方面應(yīng)用潛力巨大，逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)[28]。曲發(fā)斌等[29]采用短小芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NMCC46短小芽孢桿菌菌株對番茄種子萌發(fā)、根芽生長及幼苗株高和株重有明顯的促進(jìn)作用。Pandey等[30]發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌BS-27和枯草芽孢桿菌BS-58的組合為提高莧菜的營養(yǎng)價值提供了天然和持久的潛力，對莧菜的生長起到的促進(jìn)作用。李海薇等[31]發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌菌株 KX-33具有耐鹽堿性且能明顯縮短棉花酶出芽時間，促進(jìn)棉苗生長。Kaushal等[32]通過田間試驗(yàn)證實(shí)了短小芽孢桿菌YSPMK11的培養(yǎng)濾液對菌核病的體外生長有抑制作用，且具有較高的植物促生長特性，可作為取代花椰菜栽培系統(tǒng)中常用殺菌劑的有效生物防治劑。Padaria等[33]鑒定出短小芽孢桿菌 MTCC7615的吩嗪-1-羧酸基因（phc CD）對水稻紋枯病菌有拮抗作用。但有關(guān)短小芽孢桿菌產(chǎn)酸的報道比較少見，試驗(yàn)利用選擇培養(yǎng)基分離到了具有產(chǎn)酸能力的短小芽孢桿菌BY-2073菌株。

SOD、CAT和POD是植物活性氧清除系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，它們能有效地阻止高濃度氧的快速積累，防止膜脂的過氧化作用，延緩植物的衰老，增強(qiáng)植物抗逆性[34]。張文平等[35]采用不同濃度乳酸菌胞外多糖對水稻種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)水稻種子發(fā)芽率最高時，MDA含量明顯下降，抗逆酶活性均有不同程度提高，緩解逆境脅迫傷害效果最為顯著。蔣航等[36]采用外源褪黑素對As3+脅迫下的水稻種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)種子萌發(fā)率最高時，抗逆酶活性升高最為顯著，且MDA含量隨之降低。

試驗(yàn)也證實(shí)，經(jīng)短小芽孢桿菌發(fā)酵液與水按比例稀釋后處理的水稻種子萌發(fā)率均有提高，在種子萌發(fā)過程中SOD、CAT、POD活性亦有明顯提高，其中以按1∶30比例稀釋處理的水稻種子抗逆酶活性最為顯著，且MDA含量最低，表示該處理?xiàng)l件下的種子在萌發(fā)過程中細(xì)胞膜受到的傷害最少。這與他人的試驗(yàn)結(jié)果相似，但試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)稀釋的發(fā)酵液處理后水稻種子幾乎無法萌發(fā)，這可能與該發(fā)酵液的pH為3.7左右有關(guān)，故測定的MDA含量較低，相關(guān)抗逆酶活性也較低。

懷寶東等[37]通過試驗(yàn)證明，在水稻栽培生產(chǎn)過程中開展生物有機(jī)肥和微生物菌劑的營養(yǎng)補(bǔ)償措施，整合成減量高效施肥技術(shù)模式可達(dá)到提高肥料利用率，增加水稻產(chǎn)量的目的。

以上研究結(jié)果為在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)一步利用該菌株及其發(fā)酵液該菌株發(fā)酵液在水稻生物調(diào)酸中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。為了更好地開發(fā)該菌株，今后還將進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)酸芽孢桿菌的發(fā)酵條件，以降低成本及研發(fā)適合生產(chǎn)的生防制劑，進(jìn)一步驗(yàn)證其田間效果。