姚晨昊 路生鑫 陸宇燕* 李丕鵬* 薛百?gòu)?qiáng)

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽(yáng)，110034；2.沈陽(yáng)宏泰蛇類養(yǎng)殖有限公司，沈陽(yáng)，110168)

口腔炎對(duì)于脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)是一種常見(jiàn)的疾病[1-4]，在蛇類，尤其是人工養(yǎng)殖的蛇種更為普遍[5-9]。口腔炎是指口腔周圍由于感染而引起的炎癥，患病蛇主要表現(xiàn)為昂頭、口微張不能閉合、呼吸時(shí)有明顯的“嘶鳴”，嚴(yán)重時(shí)可引起肺炎，最終導(dǎo)致死亡?？谇谎子忻黠@的傳染性，不及時(shí)防治會(huì)引起蛇場(chǎng)的大面積傳染，死亡率極高。

由于蛇毒、蛇膽、蛇油的重要藥用價(jià)值，對(duì)其的需求量越來(lái)越大。為了緩解市場(chǎng)需求與野外種群之間的矛盾，蛇類的人工養(yǎng)殖規(guī)模在迅速擴(kuò)大。由于人工養(yǎng)殖的密度較大，蛇患病的幾率也明顯提升[7-9]。尤其在出蟄后和毒蛇采毒后，口腔炎的發(fā)病幾率急速上升。雖然國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)多種蛇的口腔炎做了深入的研究，提出來(lái)較好的治療方案，并確定了常見(jiàn)的病原菌及其耐藥性[10-12]。但對(duì)如何進(jìn)行提前預(yù)測(cè)報(bào)告疫情，均未見(jiàn)報(bào)道。這對(duì)于高密度飼養(yǎng)的蛇場(chǎng)來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)迫切需要解決的問(wèn)題。

本研究對(duì)人工飼養(yǎng)條件下患有口腔炎的烏蘇里蝮(Gloydiusussuriensis)進(jìn)行了較為全面的觀察，通過(guò)相關(guān)器官的系數(shù)、血液學(xué)指標(biāo)和激素等檢測(cè)指標(biāo)，揭示患病蛇各種生理生化特征與健康蛇之間的變化，旨在為人工養(yǎng)殖烏蘇里蝮疾病的預(yù)防和治療奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在口腔炎高發(fā)期(出眠后，5月)，對(duì)烏蘇里蝮養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)隨機(jī)選取了健康蛇和罹患口腔炎的烏蘇里蝮雄性成蛇各4條。

1.2 方法

1.2.1 解剖

將實(shí)驗(yàn)用蛇放置于含有乙醚的干燥器中進(jìn)行麻醉，待蛇體被觸及后沒(méi)有反應(yīng)時(shí)取出。將其固定于解剖板上，檢查口腔及周圍，并從肛前鱗處縱向解剖至下頜處。心臟取血后，觀察各個(gè)臟器，測(cè)量并稱重。

1.2.2 血細(xì)胞分析

取心臟血適量(10 μL/條左右)，利用北京寶靈陽(yáng)光科技有限公司生產(chǎn)的BM21半自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每條蛇的血液樣品，檢測(cè)20項(xiàng)指標(biāo)，取主要8項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析：紅細(xì)胞(RBC；1012/L)、紅細(xì)胞分布寬度(RDWSD；fL)、血小板(PLT；109/L)、白細(xì)胞(WBC；109/L)、中性粒細(xì)胞(GRA；109/L)、淋巴細(xì)胞(LYM；109/L)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞(NLR)、中間細(xì)胞(MON；109/L)。

1.2.3 激素檢測(cè)

心臟取血適量，立即利用TGL-16G-C高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，8 500 r/min。分離血清，血清量保證在25 μL左右，利用免疫酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)睪酮和雌二醇含量。試劑盒采購(gòu)自鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，利用紫外可見(jiàn)分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 相關(guān)計(jì)算方法

軀體肥滿度(g/cm3)= 軀體重(除去內(nèi)臟后的胴體重，g)/體長(zhǎng)3(cm3)[13]

器官系數(shù) =[(器官整體重量，g)/軀干重(g)]× 100%[14]

中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞(NLR)= 中性粒細(xì)胞(GRA；109/L)/淋巴細(xì)胞(LYM；109/L)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(one - way ANOVA)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析，設(shè)置P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大體解剖學(xué)

2.1.1 解剖觀察

健康烏蘇里蝮頭部背面觀(圖1-a)呈扁平的三角形，腹面觀(圖1-b)下頦鱗排列整齊；側(cè)面觀(圖1-c)口腔緊閉或微張，各部分輪廓清晰。罹患口腔炎烏蘇里蝮口腔具惡臭味，吻部?jī)蓚?cè)由于不同程度的腫脹，蛇口難以閉合(圖1-f，1-g)，可見(jiàn)牙床周圍有白色乳塊不規(guī)則狀物體附于其上(圖1-f，1-i)；最嚴(yán)重者，由于上頜腺炎癥產(chǎn)生的腫塊擠壓眼部，致使眼球突出，眼部嚴(yán)重變形(圖1-h)。解剖中未見(jiàn)其他各器官具可觀測(cè)到的實(shí)質(zhì)性病變。

圖1 烏蘇里蝮健康蛇與患口腔炎蛇頭部Fig.1 A map of the head of healthy snakes and stomatitis snakes with Gloydius ussuriensis 注：a：健康蛇頭背部；b：健康蛇腹面頭部下頜；c：健康蛇頭部側(cè)面；d：罹患口腔炎蛇頭背部；e：罹患口腔炎蛇腹面頭部下頜；f：罹患口腔炎蛇頭部側(cè)面；g：罹患口腔炎蛇的口腔；h：上頜腺炎擠壓眼球的蛇頭部側(cè)面觀；i：解剖鏡下罹患口腔炎蛇頭部側(cè)面 Note：a，Healthy snake head backside view.b，Healthy snake ventral head and lower jaw.c，Healthy snake head side view.d，Snake head backside with stomatitis.e，The ventral head and lower jaw of a snake suffering from stomatitis.f，The head side of a snake with stomatitis.g，The foral cavity of a snake suffering from stomatitis.h，Lateral view of snake head with maxillary adenitis squeezing the eyeball.i，Head side view with stomatitis snake under anatomical mirror

表1 相關(guān)生物學(xué)量度

Tab.1 Related biometrics

注：*表示呈顯著性差異(P<0.05)；**表示呈極顯著性差異(P<0.01)

Note：*indicates correlations between date(P<0.05).**indicates extermely significant correlations between date(P<0.01)

2.1.2 相關(guān)形態(tài)學(xué)測(cè)量

由表1可見(jiàn)，在體長(zhǎng)、體重和軀干重3項(xiàng)測(cè)量數(shù)值上，患病蛇均略大于健康蛇，但兩者之間無(wú)顯著性差異。雖兩者之間沒(méi)有顯著性差異，在整體肥滿度和軀干肥滿度2個(gè)比值上均顯示為健康蛇略大于患病蛇，而患病蛇這兩個(gè)指標(biāo)僅分別是健康蛇的87.16%和88.58%。在肝、腎、精巢和脂肪體重量及其器官系數(shù)中，肝重和腎重均為患病蛇略大于健康蛇，而肝系數(shù)則為患病蛇低于健康蛇，且兩者之間呈顯著性差異，但腎系數(shù)仍為患病蛇略大于健康蛇，且兩者之間無(wú)顯著性差異。精巢重和脂肪體重均為患病蛇低于健康蛇，尤其是患病蛇脂肪體重遠(yuǎn)低于健康蛇，患病蛇與健康蛇之間在精巢系數(shù)和脂肪體系數(shù)上分別呈顯著性差異和極顯著性差異。

2.2 性類固醇激素

性類固醇激素檢測(cè)結(jié)果顯示：健康蛇血睪酮(T)含量(783.29±29.32)ng/L，血雌二醇(E2)含量(87.10±10.59)ng/mL，二者均明顯高于患病蛇的血睪酮(368.13±86.68)ng/L，血雌二醇(41.24±5.77)ng/mL，且2種激素在正常蛇和患病蛇之間均呈極顯著性差異(P<0.01)。

2.3 血細(xì)胞檢測(cè)

在與紅細(xì)胞相關(guān)的2個(gè)檢測(cè)指標(biāo)中，均顯示為患病蛇高于健康蛇，且均呈顯著性差異。血栓細(xì)胞為患病蛇低于健康蛇，兩者間無(wú)顯著性差異。與白細(xì)胞相關(guān)的5項(xiàng)指標(biāo)中，患病蛇的白細(xì)胞總數(shù)幾乎是正常蛇的2倍。而在3種白細(xì)胞檢測(cè)類型中，僅患病蛇淋巴細(xì)胞數(shù)量高于正常蛇；而中性粒細(xì)胞和中間細(xì)胞的數(shù)量均表現(xiàn)為患病蛇低于正常蛇。本文注重能較為綜合地反映與機(jī)體免疫有關(guān)的2類細(xì)胞的比值，即中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞數(shù)量的比值(NLR)，結(jié)果為患病蛇NLR僅為正常蛇的1/2，二者間呈顯著性差異。

3 討論

肥滿度作為衡量動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)，在養(yǎng)殖業(yè)中有著重要的實(shí)際使用意義[15-17]，而器官質(zhì)量和器官指數(shù)也常作為機(jī)體健康與否的特征性指標(biāo)[13，18-20]。本研究中患病的烏蘇里蝮與正常蛇在養(yǎng)殖中均采用人工填喂的方式，由于患病蛇時(shí)常會(huì)出現(xiàn)吐食的現(xiàn)象而被關(guān)注。雖然有些患病蛇的體長(zhǎng)、體重和軀體重略高于健康蛇，但它們的整體肥滿度和軀干肥滿度均已明顯低于健康蛇，表明了患病蛇營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)已經(jīng)欠佳。患病蛇可能由于口腔的不適以及疼痛，導(dǎo)致了食欲減退。同時(shí)，由于炎癥的發(fā)展，加劇了機(jī)體能量和營(yíng)養(yǎng)的支出。本研究中，患病蛇的肝系數(shù)和脂肪體系數(shù)均低于正常蛇，并與正常蛇之間均有顯著性差異。而肝臟是機(jī)體最大的儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)的器官，脂肪體是蛇類儲(chǔ)存能量的器官，因此，也進(jìn)一步印證了患病蛇處于嚴(yán)重的消耗中。

表2 相關(guān)的血細(xì)胞參數(shù)

Tab.2 Relevant blood cell parameters

注：*表示呈顯著性差異(P<0.05)；**表示呈極顯著性差異(P<0.01)

Note：*Indicates correlations between date(P<0.05).** Indicates extermely significant correlations between date(P<0.01)

丘腦-垂體-性腺軸，在哺乳動(dòng)物(主要是人類和相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，例如大鼠、小鼠等)生殖腺演化和生殖細(xì)胞發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[21-27]。值得注意的是，在對(duì)手術(shù)切除頜下腺的大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第5周精巢間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的退行性變化，而其中與睪酮合成相關(guān)的酶(3β-羥基甾體脫氫酶、非特異性脂酶、琥珀酸脫氫酶)含量也出現(xiàn)了明顯降低。分析認(rèn)為，由于頜下腺是大鼠血漿表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的主要來(lái)源，被切除后內(nèi)源性的EGF缺乏，導(dǎo)致了精巢間質(zhì)細(xì)胞合成功能的降低。而精巢間質(zhì)細(xì)胞正是動(dòng)物體內(nèi)合成睪酮的重要細(xì)胞，其合成功能降低勢(shì)必影響機(jī)體血睪酮的含量，進(jìn)而影響精子的正常發(fā)育和演化[28]。雖然在爬行動(dòng)物研究中相關(guān)研究的報(bào)道較少[29-31]，但有學(xué)者指出雄性爬行動(dòng)物精子演化和發(fā)育的整個(gè)過(guò)程是一個(gè)依賴睪酮(T)的過(guò)程[29、32]。在本研究中，患有口腔炎的雄性烏蘇里蝮血睪酮和雌二醇含量均明顯低于健康蛇，而對(duì)患病烏蘇里蝮精巢結(jié)構(gòu)的觀察也發(fā)現(xiàn)了生精過(guò)程明顯滯后于健康蛇(待發(fā)表)?？谇谎资且环N口腔黏膜以及口腔周邊相關(guān)腺體出現(xiàn)炎癥的疾病[10]?；疾∩呤欠裼捎诳谇谎装Y導(dǎo)致了相關(guān)腺體的結(jié)構(gòu)和功能異常，致使患病蛇其內(nèi)源性的EGF的分泌降低，進(jìn)而影響精巢及其間質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能還有待于進(jìn)一步積累資料并深入研究。但本文患病蛇的精巢系數(shù)低于正常蛇，兩者呈顯著性差異，在一定程度上提供的佐證。

血細(xì)胞參數(shù)可以及時(shí)反應(yīng)出動(dòng)物自身的生理狀態(tài)改變以及機(jī)體對(duì)外界環(huán)境變化產(chǎn)生的應(yīng)激性。在醫(yī)學(xué)研究中有大量深入探究血細(xì)胞參數(shù)與疾病關(guān)系的報(bào)道[33-34]。國(guó)內(nèi)外有關(guān)爬行類血細(xì)胞參數(shù)也有很多的積累[35-36]，但關(guān)于烏蘇里蝮血細(xì)胞參數(shù)的報(bào)道極少，尤其是針對(duì)蛇類疾病診斷和治療的相關(guān)血細(xì)胞參數(shù)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文首次報(bào)道了罹患口腔炎的烏蘇里蝮血細(xì)胞參數(shù)，同時(shí)顯示出罹患口腔炎的烏蘇里蝮的血細(xì)胞參數(shù)中有近80%均與健康蛇有顯著性差異。其中值得注意有兩個(gè)指標(biāo)，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比值(NLR)和紅細(xì)胞分布寬度。有研究指出NLR是全身性炎癥反應(yīng)的有效評(píng)估指標(biāo)之一，可以反映機(jī)體的炎癥狀態(tài)[37]。而紅細(xì)胞分布寬度(RDW)雖然僅是紅細(xì)胞體積大小的異質(zhì)性指標(biāo)，但當(dāng)機(jī)體有炎癥發(fā)生時(shí)，大量的炎癥因子可以抑制促紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)的紅細(xì)胞成熟過(guò)程，另一方面炎癥引起的紅細(xì)胞出現(xiàn)以細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞半衰期以及紅細(xì)胞膜變性等為主的病理性變化，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞的異質(zhì)性增加[38]。本研究中RDW和NLR與人類醫(yī)學(xué)研究的結(jié)果相符，但由于樣本量不夠充足，是否能夠?qū)⑦@兩個(gè)指標(biāo)作為今后診斷蛇類炎癥的有效指標(biāo)還有待于進(jìn)一步積累資料。