陳平男 楊 欣 盧筱瀟 張 寧 崔 瑾*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)為自身免疫疾病，主要表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫痛、軟骨和骨破壞和關(guān)節(jié)畸形等。目前，研究者不斷研究與開發(fā)防治RA的藥物[1]，包括中藥、單體及中藥復(fù)方[2]。中藥在防治RA疾病中發(fā)揮重要作用，中藥的毒副作用較少，凸顯其在RA中的作用優(yōu)勢(shì)。中藥單體、復(fù)方防治RA均有報(bào)道。曾光等[3]研究熊果酸對(duì)RA及骨質(zhì)破壞具有一定的作用；黃明進(jìn)等[4]發(fā)現(xiàn)黑骨藤具有防治RA的作用；李健等[5]采用中藥方劑治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。中藥化學(xué)成分諸多，活性成分與靶標(biāo)蛋白結(jié)合，對(duì)疾病的治療中發(fā)揮協(xié)同作用，但是中藥的活性成分經(jīng)過提取分離，從分子水平(蛋白、基因)探討其藥理作用的過程比較復(fù)雜。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高，多學(xué)科的交叉，分子對(duì)接迅速發(fā)展,在中醫(yī)藥中廣泛應(yīng)用[6]。分子對(duì)接將中藥、中藥復(fù)方、天然產(chǎn)物等小分子與疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)(蛋白)進(jìn)行幾何匹配和能量匹配。查找空間和能量與之最佳契合的生物大分子,是快速的發(fā)現(xiàn)藥物作用潛在靶標(biāo)的新方法[7]。

大血藤為大血藤科藤本植物大血藤(Sargentodoxacuneata(Oliv) Rehd.et Wils.)的干燥藤莖、根，又稱為“血藤”。用藥歷史悠久，臨床應(yīng)用廣泛,具有活血散瘀、強(qiáng)筋骨、止痛通經(jīng)的功效。目前，大血藤主要集中在抗菌、抗炎、抗病毒等藥理作用[8]。但是大血藤抗炎活性成分及靶標(biāo)蛋白并不清楚，因此對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，為中藥開發(fā)及中藥活性成分應(yīng)用提供理論依據(jù)。以研究大血藤抗RA的活性成分及機(jī)制為目的，從整體層面，運(yùn)用分子對(duì)接結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，闡釋中藥功能描述與現(xiàn)代藥理之間的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)篩選 RA的潛在靶標(biāo)基因通過CTD進(jìn)行篩選，在線打開CTD，在疾病名稱中輸入“Arthritis, Rheumatoid”為關(guān)鍵詞檢索RA的相關(guān)靶點(diǎn)，選擇已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的“M”或“T”為靶標(biāo)，統(tǒng)計(jì)RA靶點(diǎn)的數(shù)量。

1.2 通路分析 基于DAVID(https://david. ncifcrf.gov/)和KOBAX3.0(KEGG Orthology Based Annotation System)對(duì)RA靶標(biāo)基因進(jìn)行通路富集分析，DAVID是基于WEB服務(wù)器的富集分析軟件。對(duì)RA靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能、通路和疾病分析等；KOBAS軟件的功能模塊中有ID Mapping，將RA基因通過數(shù)據(jù)庫富集到相應(yīng)的通路中。分析結(jié)果得到RA靶點(diǎn)參與的通路途徑，選擇RA靶點(diǎn)顯著參與的途徑(P≤0.01)，基于Rstudio軟件中的ggplot 2繪制氣泡圖，包括通路名稱、富集分析的P值、Rich factor和Q值等。

1.3 相互作用分析 采用STRING結(jié)合Cytoscape 3.5.1對(duì)RA通路中16個(gè)RA靶點(diǎn)進(jìn)行相互作用分析，STRING是蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，可進(jìn)行是搜索已知蛋白之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用，通過蛋白質(zhì)名稱進(jìn)行檢索16個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的相關(guān)性。

1.4 大血藤活性成分篩選 大血藤小分子化合物基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology ,TCMSP)下載[9]，通過大血藤名稱查找活性成分。對(duì)大血藤關(guān)鍵化學(xué)成分進(jìn)行分子量(MW)、氫鍵供體數(shù)(Hdon)、氫鍵受體數(shù)(Hacc)、生物利用度(OB)、血腦屏障(BBB)、藥物對(duì)小腸上皮細(xì)胞的穿透性和類藥性等進(jìn)行分析。基于SYBYL2.1.1對(duì)大血藤活性成分進(jìn)行加氫和加電荷[10]，對(duì)活性成分進(jìn)行 Minimize 能量?jī)?yōu)化，保存為SLN格式。

1.5 分子對(duì)接 采用SYBYL2.1 軟件的Surflex-Dock 模塊對(duì)大血藤活性成分與RA靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接研究[11]。從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 下載白細(xì)胞介素-6(PDBID∶1ALU)、人白介素1β(PDBID∶1RWN)、腫瘤壞死因子(PDBID∶2AZ5)、toll樣受體2(PDBID∶1FYW)、白細(xì)胞介素18(PDBID∶3WO2)、白細(xì)胞介素23A(PDBID∶3QWR)、人集落刺激因子2(PDBID∶5C7X)、干擾素-γ(PDBID∶1EKU)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(PDBID∶3BDY)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(PDBID∶3OSK)3D 晶體結(jié)構(gòu)。選擇原配體模式產(chǎn)生活性口袋，分子對(duì)接結(jié)果以Total-Score>5為閾值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)篩選及通路分析 基于CTD 篩選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶標(biāo)基因，以“Arthritis, Rheumatoid”為關(guān)鍵詞檢索類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)靶點(diǎn)，選擇已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的“M”或“T”為靶標(biāo)，共篩選出175個(gè)RA的靶標(biāo)基因。

采用DAVID 對(duì)RA靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析，得到RA靶點(diǎn)參與的所有途徑，篩選出RA靶點(diǎn)顯著參與的通路途徑(P<0.01)，175個(gè)RA靶點(diǎn)參與38條代謝途徑，輸出前10條通路(圖1)，包括RA通路(P-Value=2.01E-11)。采用KOBAX對(duì)RA靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析，175個(gè)RA靶點(diǎn)參與85條代謝途徑，輸出前10條通路(圖2)，包括RA通路(P-Value=6.04E-20)。

RA通路中包括16個(gè)靶標(biāo)基因(TNF、IL-6、TLR2、IL1β、IL18、IL23A、CSF2、VEGF2、IFNG、CTLA4、CXCL8、CD28、 CXCL6、HLA-DPB1、HLA-DRB1、HLA-DQA2)，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫RA通路中靶標(biāo)基因具有一致性。

2.2 RA通路靶點(diǎn)相互作用分析 采用STRING結(jié)合Cytoscape 3.5.1對(duì)RA通路中16個(gè)靶標(biāo)基因進(jìn)行相互作用分析，結(jié)果顯示整個(gè)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)緊密。圖3表明： TNF、VEGFA 、CTLA4和 IFNG等為中心靶點(diǎn)，去掉后，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)渙散。

2.3 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白 通過蛋白相互作用分析，根據(jù)degree(度)的大小，選擇有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行生物學(xué)效應(yīng)分析[12-13]。詳見表2。

表2 關(guān)鍵靶標(biāo)的基本信息

2.4 分子對(duì)接結(jié)果 本次研究將處理好的 23個(gè)小分子分別與 10個(gè)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行能量匹配，原配體與10個(gè)靶標(biāo)蛋白結(jié)合的總分為42.5，選擇總分大于42.5且與靶點(diǎn)結(jié)合的數(shù)量大于7為抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性成分。通過篩選明確大血藤化學(xué)成分谷甾醇(MOL000359)與7個(gè)靶點(diǎn)(IL-6、TNF、IL1B、IL18、CSF2、VEGFA、TLR2)結(jié)合較好，且分子對(duì)接總分為43；毛柳甙(MOL003341)與7個(gè)靶點(diǎn)(L-6 、TNF、IL1B、IL18、IL23A、VEGFA、IFNG)結(jié)合較好，且分子對(duì)接總分為49；內(nèi)消旋二氫愈創(chuàng)木酯酸(MOL007920)與7個(gè)靶點(diǎn)(TNF、IL1B、IL18、IL23A、CSF2、VEGFA、TLR2)結(jié)合較好，且分子對(duì)接總分為48。谷甾醇、毛柳甙、內(nèi)消旋二氫愈創(chuàng)木酯酸為大血藤發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分。

大血藤23個(gè)化學(xué)成分，其中11個(gè)化學(xué)成分能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)；9個(gè)化學(xué)成分能調(diào)節(jié)白介素1β(IL1β)；8個(gè)化學(xué)成分能調(diào)節(jié)toll樣受體2(TLR2)。腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、白介素1β、toll樣受體2為大血藤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白。詳見圖4。

2.5 關(guān)鍵化學(xué)成分的理化性質(zhì) 大血藤抗RA的關(guān)鍵活性成分谷甾醇、毛柳甙、內(nèi)消旋二氫愈創(chuàng)木酯酸進(jìn)行ADME/T性質(zhì)分析。根據(jù)Lipinski規(guī)則，化合物應(yīng)該具備氫鍵受體數(shù)(Hacc)<10，分子量(MW)<500，氫鍵供體數(shù)(Hdon)<10，生物利用度(OB)≥30%，藥物對(duì)小腸上皮細(xì)胞的穿透性≥-0.4，血腦屏障(BBB)≥-0.3，類藥性≥0.18。如果過多參數(shù)不符合，會(huì)影響藥物的溶解性及腸吸收能力，谷甾醇、內(nèi)消旋二氫愈創(chuàng)木酯酸、毛柳甙基本遵循Lipinski規(guī)則(表3)。谷甾醇、內(nèi)消旋二氫愈創(chuàng)木酯酸、毛柳甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)詳見圖5。

表3 關(guān)鍵化學(xué)成分物理化性質(zhì)

注：A 谷甾醇 B毛柳甙 C Meso-dihydroguaiaretic acid。

3 討論

本研究從大血藤活性成分、RA靶點(diǎn)、通路、相互作用等幾個(gè)方面進(jìn)行討論。RA是一種慢性自身免疫性疾病，越來越多的證據(jù)表明，RA的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，多種生物學(xué)過程和多條信號(hào)通路參與了RA損傷進(jìn)程。本研究篩選出的175個(gè)RA靶點(diǎn)主要參與TNF，Toll-like receptor 等通路釋放炎性細(xì)胞因子及促炎因子。大血藤可能通過多成分-多靶點(diǎn)或多成分-單靶點(diǎn)干預(yù)炎癥、免疫通路減少炎性細(xì)胞因子與促炎因子的釋放。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，系統(tǒng)篩選大血藤治療RA可能的活性成分及分子機(jī)制，為治療RA提供新的切入點(diǎn)。本研究?jī)H初步闡釋了其合理性，尚存在一些局限性。

目前，多種生物制劑在RA的治療環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用[14]。但是RA疾病反復(fù)發(fā)作，尚未有根治的方法，臨床上存在治療難點(diǎn)。RA的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，并不是單條通路發(fā)揮作用，而是多條通路共同作用，需要不斷研究防治RA的靶向藥物。本研究采用分子對(duì)接明確大血藤通過多成分-多靶點(diǎn)協(xié)同治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，11個(gè)活性成分與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)和腫瘤壞死因子(TNF) 有較好的結(jié)合；9個(gè)活性成分與白介素1β ( IL1β )有較好的結(jié)合；8個(gè)化學(xué)成分能調(diào)節(jié)toll樣受體2(TLR2)。已經(jīng)有研究者發(fā)現(xiàn)大血藤對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞MMP-9、MMP-2、血清TNF-α和IL-6有調(diào)節(jié)作用[15-16]。RA的發(fā)生、發(fā)展與多種細(xì)胞因子相關(guān)，已經(jīng)有研究表明：TNF為RA發(fā)病的主要促炎因子之一，促進(jìn)炎癥持續(xù)反應(yīng)，軟骨及骨的破壞，已經(jīng)開發(fā)抗TNF-α藥物[17]。VEGFA為血管生成促進(jìn)因子之一，主要影響器官的發(fā)育、組織再生、血管滲透等[18]。IL是致炎性因子，促進(jìn)大量炎癥細(xì)胞的聚集，開發(fā)抑制IL的表達(dá)已經(jīng)成為治療RA的新方法[19]。總之，TNF、VEGFA、IL1β和TLR2可能為大血藤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。同時(shí)通過本次研究發(fā)現(xiàn):谷甾醇、毛柳甙、內(nèi)消旋二氫愈創(chuàng)木酯酸為大血藤發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分。已經(jīng)有研究表明:毛柳甙具有抗腫瘤、抗衰老、心血管保護(hù)和調(diào)節(jié)免疫等廣泛的藥理活性[20-21]；谷甾醇為植物界最普遍存在的甾醇，在降血膽固醇、抗炎、抗腫瘤等藥理作用中發(fā)揮重要作用。本研究初步明確了大血藤抗類風(fēng)濕性關(guān)鍵炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)及活性成分。