劉菲，張昊，劉博，譚文

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006)

腦卒中是腦血管阻塞或破裂引起的急性缺血缺氧性腦病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，在我國(guó)，腦卒中的致死率居各類(lèi)疾病的首位，每年造成至少600萬(wàn)人死亡,而永久性缺血性腦卒中又是其中很重要的一部分[1-2]。N2a細(xì)胞是小鼠神經(jīng)元母細(xì)胞瘤細(xì)胞株[3]，是目前研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要模式細(xì)胞。研究體外缺氧常用氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)N2a細(xì)胞缺氧損傷模型，該模型通過(guò)化學(xué)缺氧能夠很好地模擬體內(nèi)缺氧過(guò)程，但具體機(jī)制仍不十分明確。本研究擬采用CoCl2處理N2a細(xì)胞建立缺氧模型，并通過(guò)觀察細(xì)胞缺氧損傷情況探討細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制，為相關(guān)藥物研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)類(lèi)試劑與JC-1試劑(T3168)、DAPI染色液(1217226)購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；DCFH-DA探針(SLBF6547V)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；IKK(3416)、p-IKK(2697)、NF-κB(8242)、p-NF-κB(3033)購(gòu)于CST公司；細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)試劑盒(C1098)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CoCl2誘導(dǎo)N2a細(xì)胞化學(xué)缺氧模型的建立 參考Gotoh等[4]的方法建立缺氧模型，將細(xì)胞分為正常組和CoCl2處理組，正常組用無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，CoCl2處理組用無(wú)糖培養(yǎng)基配制，濃度分別為：10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、600 μmol/L、1 200 μmol/L，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8方法檢測(cè)N2a細(xì)胞活性 在96孔板上每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞，按照“1.2.1”建立缺氧模型后檢測(cè)細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(對(duì)照孔吸光度-實(shí)驗(yàn)空白孔吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白孔吸光度)。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)體外細(xì)胞凋亡 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)收集細(xì)胞，染色后在熒光顯微鏡下選取10個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞凋亡率,凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 線粒體膜電位的測(cè)定 按照“1.2.1”造模后，配制1 μg/mL 的JC-1工作液，37 ℃避光孵育20 min，PBS清洗后，放置于共聚焦顯微鏡下拍攝，每組選取10個(gè)視野，計(jì)算紅色熒光與綠色熒光比值。

1.2.5 活性氧(ROS)檢測(cè) N2a細(xì)胞在CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧24 h后，加入10 μmol/L的DCFH-DA探針，37 ℃避光染色20 min后置于激光共聚焦顯微鏡下拍攝，每組選取10個(gè)視野計(jì)算綠色熒光的含量。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) 在激光共聚焦專(zhuān)用皿上種1×105個(gè)細(xì)胞，建模后經(jīng)多聚甲醛固定30 min后用TritonX-100通透，室溫下用2%的BSA封閉80 min。在激光共聚焦專(zhuān)用皿中心滴加50 μL NF-κB抗體(1∶50)，4 ℃過(guò)夜。第2天用PBST清洗后加入熒光二抗，室溫下孵育90 min。用DAPI染核后在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.7 Western blot測(cè)定實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按照建模方法處理后，提取總蛋白，以β-actin為內(nèi)參抗體，將各目標(biāo)條帶與內(nèi)參做均一化處理，對(duì)比結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下對(duì)N2a細(xì)胞活性的影響

不同濃度的CoCl2處理N2a細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率隨著CoCl2濃度的增加而降低，由圖1可知，10～100 μmol/L CoCl2損傷細(xì)胞相對(duì)存活率均大于80%，300 μmol/L的CoCl2處理后細(xì)胞活力為56.16%，600 μmol/L CoCl2損傷細(xì)胞相對(duì)存活率為32.10%，1 200 μmol/L CoCl2處理后，細(xì)胞存活率僅為10%左右。

與正常組比較：*P< 0.05，**P<0.01。

圖1 不同濃度CoCl2對(duì)N2a細(xì)胞活性的影響

Figure 1 Effect of different concentrations of CoCl2on the activity of N2a cells

2.2 不同濃度CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下對(duì)N2a細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度的CoCl2處理N2a細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率隨著CoCl2濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，10 μmol/L和50 μmol/L的CoCl2對(duì)細(xì)胞的凋亡率都小于20%，100 μmol/L的CoCl2對(duì)細(xì)胞的凋亡率為23%左右，300 μmol/L的CoCl2對(duì)細(xì)胞的凋亡率為38%，而600 μmol/L的CoCl2對(duì)細(xì)胞的凋亡率達(dá)到67%，1 200 μmol/L的CoCl2對(duì)細(xì)胞的凋亡率達(dá)到88%。

與正常組比較：**P< 0.01。

圖2 不同濃度CoCl2對(duì)N2a細(xì)胞凋亡的影響

Figure 2 Effect of different concentrations of CoCl2on apoptosis of N2a cells

2.3 CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖3所示，A圖為模型建立后，經(jīng)過(guò)1 μg/μL的JC-1處理后，confocal拍攝的N2a細(xì)胞線粒體膜電位圖,其中紅色的熒光是JC-1多聚體,綠色熒光為JC-1單聚體。由圖3A中可以看出,正常組細(xì)胞多表達(dá)為JC-1多聚體,線粒體形態(tài)清晰,均勻分布在細(xì)胞核四周,300 μmol/L CoCl2處理后綠色熒光增強(qiáng)。B圖為線粒體膜電位的統(tǒng)計(jì)圖，從圖中可以看出,經(jīng)CoCl2處理后,紅色熒光與綠色熒光比值降低,線粒體膜電位降低(P<0.05)。

A．激光共聚焦掃描顯微鏡拍攝的JC-1染色后的N2a細(xì)胞，紅色為JC-1多聚體，綠色為JC-1單聚體； B.線粒體膜電位即A圖中紅色熒光與綠色熒光比值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。與正常組比較：*P<0.05。

圖3 300 μmol/L CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 3 Effect of 300 μmol/L CoCl2-induced hypoxia on MMP of N2a cells

2.4 CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖4所示，A圖為10 μmol/L的DCFH-DA探針染色后用confocal拍攝的細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光圖，其中ROS表達(dá)綠色熒光。B圖為其對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)圖。細(xì)胞缺氧損傷會(huì)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，過(guò)量的ROS會(huì)氧化損傷細(xì)胞多種DNA、蛋白和脂質(zhì)，最后導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷。綠色熒光的強(qiáng)弱代表細(xì)胞內(nèi)ROS含量的多少，由圖4可以看出，經(jīng)過(guò)CoCl2刺激后，細(xì)胞中綠色熒光明顯增多，與正常組比較，CoCl2組ROS含量為正常組的4倍左右，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.細(xì)胞拍攝的confocal圖片，綠色熒光為細(xì)胞內(nèi)ROS的含量； B.ROS含量的統(tǒng)計(jì)圖。與正常組比較：**P< 0.01。

圖4 300 μmol/L CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞內(nèi)ROS水平

Figure 4 ROS level in N2a cells under hypoxia induced by 300 μmol/L CoCl2

2.5 CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響

由圖5可以看出，正常培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)免疫熒光染色后可發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白(綠色熒光)集中在胞質(zhì)中，胞核(藍(lán)色熒光)清晰，Merge圖可以明顯看到NF-κB蛋白集中表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中；而經(jīng)過(guò)CoCl2缺氧培養(yǎng)24 h后，能明顯看到綠色熒光均勻分布在整個(gè)細(xì)胞中，與正常組相比，細(xì)胞核中綠色熒光明顯增多，說(shuō)明CoCl2誘導(dǎo)促進(jìn)了NF-κB的入核，而NF-κB信號(hào)通路的作用主要是基于NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)相應(yīng)的促炎促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)達(dá)到相應(yīng)的病理進(jìn)程，進(jìn)一步確定了CoCl2對(duì)細(xì)胞的損傷。

2.6 Western blot檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)

由圖6可以看出，正常組細(xì)胞IKK、p-IKK、NF-κB、p-NF-κB這兩組蛋白條帶不明顯，蛋白含量較低，而經(jīng)過(guò)CoCl2誘導(dǎo)刺激后各蛋白條帶明顯增寬(圖6A)，由統(tǒng)計(jì)圖(圖6B)可以看出，經(jīng)過(guò)CoCl2誘導(dǎo)刺激后IKK、p-IKK、NF-κB、p-NF-κB蛋白含量均增加(P<0.01)，說(shuō)明CoCl2誘導(dǎo)激活了IKK信號(hào)通路，使p-IKK的磷酸化水平增加，同時(shí)被激活的還有NF-κB與p-NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)一系列反應(yīng)。

2.7 CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞表達(dá)NF-κB信號(hào)通路激活后對(duì)下游凋亡因子表達(dá)的影響

由圖7中可以看出，經(jīng)過(guò)CoCl2處理后，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而B(niǎo)ax和 Cleaved caspase-3條帶增寬，含量明顯增加，且通過(guò)右圖可以看出，各蛋白表達(dá)差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，具體表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡加劇，促凋亡因子顯著增加，抗凋亡因子顯著降低。

圖5 免疫熒光法測(cè)CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞NF-κB蛋白的表達(dá)( 100×)

Figure 5 Expression of NF-κB in N2a cells under hypoxia induced by CoCl2(100×)

A.不同蛋白的蛋白印記圖； B.對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)圖。與正常組比較：**P<0.01。

圖6 CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞NF-κB及其相關(guān)蛋白的表達(dá)
Figure 6 Expression of NF-κB and its related proteins in N2a cells under CoCl2-induced hypoxia

A.不同蛋白的蛋白印記圖； B.對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)圖。與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖7 CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧條件下N2a細(xì)胞NF-κB下游凋亡因子的表達(dá)
Figure 7 Expression of NF-κB downstream apoptosis factors in N2a cells under CoCl2-induced hypoxia

3 討論

目前體外模擬腦卒中的方式有2種，一種為低壓氧艙培養(yǎng)法[5]，通過(guò)建立氧糖剝奪模型來(lái)模擬缺氧缺糖的環(huán)境，另一種是化學(xué)誘導(dǎo)法[6]，在細(xì)胞或者組織培養(yǎng)液中添加鐵的螯合劑，阻斷氧信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)估永久性缺血造成的腦卒中，用氧糖剝奪模型需要特殊的缺氧培養(yǎng)設(shè)備來(lái)精確控制氧氣濃度，且造模后由于環(huán)境因素容易造成復(fù)灌，實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性不好，限制了其在實(shí)驗(yàn)中的廣泛使用。故用化學(xué)誘導(dǎo)法去模擬永久性缺血更適宜。雖然已經(jīng)有研究應(yīng)用CoCl2來(lái)誘導(dǎo)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)、PC12細(xì)胞、 SH-SY5Y細(xì)胞等來(lái)評(píng)價(jià)缺血，但不同的研究中，CoCl2建模的量效關(guān)系是不同的，不同細(xì)胞的最適宜濃度分布在200～1 000 μmol/L之間[6-9]，且N2a細(xì)胞是目前研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要模式細(xì)胞，具有類(lèi)似神經(jīng)元形態(tài)和功能的特性，能夠很好地反映腦卒中發(fā)生過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞的變化。用CoCl2誘導(dǎo)N2a細(xì)胞來(lái)建立模型，模擬的是永久性缺血造成的腦卒中的病理生理變化，通過(guò)對(duì)該模型的具體機(jī)制研究，可以有針對(duì)地研發(fā)藥物來(lái)解決永久性缺血所造成的腦損傷。本實(shí)驗(yàn)參照Gotoh等[4]設(shè)計(jì)永久性缺氧實(shí)驗(yàn)的方式選擇化學(xué)誘導(dǎo)法建立模型并進(jìn)行優(yōu)化，摸索了最適宜的CoCl2誘導(dǎo)N2a細(xì)胞缺氧缺糖模型的最適宜條件，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力和Tunnel測(cè)細(xì)胞凋亡2個(gè)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)參考Miglio等[10]選擇缺氧條件的標(biāo)準(zhǔn)，確定300 μmol/L CoCl2誘導(dǎo)缺氧符合構(gòu)建永久性缺血穩(wěn)定模型的要求。

線粒體膜電位是線粒體形態(tài)和功能完整性的重要指標(biāo)，測(cè)量線粒體膜電位是探究缺氧模型機(jī)制的必要條件[11]。實(shí)驗(yàn)采用JC-1進(jìn)行線粒體染色，正常組線粒體完整、膜電位較高；300 μmol/L CoCl2處理24 h后，線粒體膜電位降低到正常組的60%左右，線粒體膜電位降低，進(jìn)而發(fā)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的ROS。同時(shí)，過(guò)量的ROS又可以造成線粒體損傷，ROS與線粒體損傷之間產(chǎn)生惡性循環(huán)，進(jìn)而造成更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷。同時(shí)過(guò)量ROS又能夠激活下游的MAPK家族及caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，抑制細(xì)胞中過(guò)量的ROS、保護(hù)線粒體的形態(tài)和功能是開(kāi)發(fā)治療腦卒中藥物考慮的重要方面。

NF-κB是由5個(gè)亞單位構(gòu)成的同源或異源二聚體。在正常狀態(tài)下與IκB結(jié)合以無(wú)活性的狀態(tài)留于細(xì)胞漿[13]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，IKKs復(fù)合體磷酸化，使IκB發(fā)生構(gòu)象改變而與NF-κB解離，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)增高[14]。此外，有研究指出Bcl-2是通過(guò)抑制細(xì)胞膜中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、抑制活性氧的蓄積發(fā)揮作用的[15-16]，也能夠干擾NF-κB入核的遷移[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞經(jīng)過(guò)CoCl2處理后，胞核內(nèi)的NF-κB含量增加，NF-κB入核明顯，同時(shí)下游的凋亡因子蛋白含量增多，抗凋亡因子Bcl-2含量降低。

綜上所述，300 μmol/L CoCl2可以穩(wěn)定誘導(dǎo)N2a細(xì)胞缺氧模型，可以顯著抑制細(xì)胞活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；其主要缺氧損傷機(jī)制是通過(guò)促凋亡作用產(chǎn)生，而胞內(nèi)線粒體膜電位的下調(diào)、 ROS的含量的增加、NF-κB的入核和促凋亡蛋白含量的增加共同作用誘導(dǎo)了CoCl2對(duì)N2a細(xì)胞的損傷。