高柳芳，李晨*

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（太原 030006）

胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，分子質(zhì)量在20～30 kDa范圍內(nèi)，專一水解堿性氨基酸如精氨酸及賴氨酸羧基形成的肽鍵，不僅能夠消化普通蛋白質(zhì)，還可以激活胰臟中的其它蛋白酶原，如胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原、彈性蛋白酶原、磷脂酶原等[1]。作為一種非常重要的專一性消化酶，胰蛋白酶被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、畜牧和現(xiàn)代生物技術(shù)等領(lǐng)域[2-4]。食品加工中作為酶制劑主要用于焙烤[5]、肉類嫩化和組織蛋白的水解[6]等。臨床上常用于治療膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等，還可用于治療毒蛇咬傷[7]。生物技術(shù)領(lǐng)域中主要用于蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析及動物細(xì)胞培養(yǎng)前對組織的消化處理等[8]。胰蛋白酶的應(yīng)用日益廣泛，對其制備方法的研究也成為當(dāng)前的一個(gè)熱點(diǎn)。目前，常用的蛋白酶分離純化方法有硫酸銨沉淀法、有機(jī)溶劑分級、離子交換層析、凝膠過濾等。然而這些方法的特異性比較低，通常需要綜合多種方法才能達(dá)到純化的目的，存在操作繁瑣、時(shí)間較長等一系列問題，而且由于操作時(shí)間長，還可能對酶活性造成不同程度的破壞[9-10]。因此，建立一種簡便、快速、高效分離純化胰蛋白酶的方法顯得尤為重要。

親和層析是利用生物大分子的生物學(xué)特異性（如酶與酶抑制劑），即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。與其他純化方法相比，親和層析具有高效、迅速的優(yōu)點(diǎn)，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化的目的。將酶抑制劑固定化做成親和層析材料特異吸附純化對應(yīng)的酶是一種有效可行的方法[11]。然而，親和層析配體需滿足非特異性吸附低、純度高、親和作用力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，尋找合適的抑制劑是制備酶親和材料的首要關(guān)鍵問題。蕎麥胰蛋白酶抑制劑（Buckwheat trypsin inhibitor，BTI）是從蕎麥種子中提取出的一種胰蛋白酶的競爭型抑制劑。課題組通過基因工程技術(shù)獲得了重組BTI，對其活性位點(diǎn)、空間結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)已進(jìn)行了詳盡研究。BTI由69個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為7.9 kDa，具有很高的耐熱性及酸堿穩(wěn)定性，100℃處理60 min對胰蛋白酶的抑制作用仍可保留在80%以上[12-14]。BTI良好的穩(wěn)定性及對胰蛋白酶較強(qiáng)的抑制作用適于固定化反應(yīng)，能夠用于制備親和層析介質(zhì)。

試驗(yàn)選用溴化氰活化的瓊脂糖凝膠作為載體，將其與配基BTI偶聯(lián)制備成親和層析吸附劑，并進(jìn)一步研究BTI親和層析介質(zhì)用于純化胰蛋白酶的作用條件，實(shí)現(xiàn)一步層析得到高純度胰蛋白酶的目的，為今后大規(guī)模制備胰蛋白酶及開發(fā)新型胰蛋白酶提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

胰蛋白酶、C N B r 活化瓊脂糖凝膠（C N B r- Sepharose CL-4B）購于生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)R-250購于北京索萊寶科技有限公司；苯甲酰-DL-精氨酰-對硝基苯氨（BApNA）為美國Sigma產(chǎn)品，其余試劑為分析純。

恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，上海美鋪達(dá)儀器有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BSA224S精密電子天平，德國Sartorius公司；PB-10精密pH計(jì)，德國Sartorius公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組蛋白BTI的制備

向液體LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL Kan和100 μg/mL Kan）中接入含有pQE30-BTI的E.coliBL21（DE3）菌種，于37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入誘導(dǎo)劑IPTG（終濃度為0.5 mmol/L），繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，以8 000 r/min離心收集菌體。用Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L，pH 7.3）將菌體洗滌三次，用相同Tris-HCl緩沖液將菌體重懸，在冰浴條件下超聲破碎，直至菌體懸浮液由黏稠變?yōu)橥噶痢⑵扑榈木涸?0℃加熱30 min，然后以12 000 r/min離心10 min，取上清，即得BTI粗蛋白。

重組蛋白BTI帶有6×His標(biāo)簽，采用親和層析法純化，在蛋白純化系統(tǒng)（美國BIO-RAD）上進(jìn)行，檢測280 nm處吸光度，流速控制為1 mL/min。用緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.5）平衡Ni2+-NTA親和層析柱，將表達(dá)的菌體粗蛋白用0.22 μm濾膜過濾后上樣于親和層析柱，用平衡緩沖液充分洗去未結(jié)合蛋白后，分別用咪唑濃度為80和300 mmol/L的緩沖液（均含20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.5）洗脫親和柱。收集洗脫峰，進(jìn)行胰蛋白酶抑制活性的測定。收集活性峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析，用Superdex G-25脫鹽柱將BTI的緩沖液置換為NaHCO3溶液（20 mmol/L，pH 8.0）后，進(jìn)一步用真空冷凍干燥機(jī)凍干得到BTI干粉。

1.2.2 BTI-Sepharose親和材料的制備

用碳酸鈉緩沖液（250 mmol/L，pH 9.0）溶解BTI，并調(diào)整BTI濃度為5 mg/mL。用去離子水清洗CNBr活化瓊脂糖凝膠表面的溶劑后，繼續(xù)用碳酸鈉緩沖液浸泡并洗滌。將凝膠與BTI溶液混合，在搖床上振蕩，于25℃偶聯(lián)6 h。然后加入Tris-HCl緩沖液（250 mmol/L，pH 8.3），繼續(xù)反應(yīng)6 h封閉剩余的活性基團(tuán)。將偶聯(lián)了BTI的凝膠填料裝于柱中，分別用1 mol/L NaCl溶液和蒸餾水清洗10個(gè)柱床體積，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BTI-Sepharose柱對胰蛋白酶的親和作用

用緩沖液（pH 7.2，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl）平衡制備好的BTI-瓊脂糖親和層析柱。用相同的緩沖液配制胰蛋白酶溶液（濃度為30 mg/mL），過0.22 μm濾膜后，取1 mL上樣于親和層析柱，流速控制為1 mL/min，然后用HAc-NaAc緩沖液（pH 3.5，100 mmol/L）洗脫。檢測280 nm處吸光度，收集蛋白峰，測定胰蛋白酶活性。

1.2.3.1 pH對BTI-Sepharose吸附胰蛋白酶的影響

用pH 7.2的20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl緩沖液平衡BTI-瓊脂糖親和層析柱，取100 μL胰蛋白酶（30 mg/mL），與250 μL牛血清白蛋白（5 mg/mL）溶液混合后，上樣于層析柱，流速控制為1 mL/min，用pH 3.5的HAc-NaAc緩沖液（100 mmol/L）洗脫。收集穿透峰與洗脫峰，測定胰蛋白酶的活性，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

改變緩沖液pH，用pH 5.0的20 mmol/L HAc-NaAc，50 mmol/L NaCl緩沖液平衡BTI-瓊脂糖親和層析柱，其它操作同上，研究不同pH對BTI-瓊脂糖凝膠吸附胰蛋白酶的影響。

1.2.3.2 pH對BTI-Sepharose解吸附胰蛋白酶的影響

取100 μL 30 mg/mL胰蛋白酶，與250 μL 5 mg/mL牛血清白蛋白溶液混合后上樣于親和層析柱，平衡緩沖液為Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，pH 7.2，流速控制為1 mL/min。上樣后，用pH 4.5的HAc-NaAc緩沖液（100 mmol/L）洗脫層析柱。分別收集穿透峰與pH 4.5緩沖液洗脫峰，測定各蛋白峰胰蛋白酶活性，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.4 胰蛋白酶活性測定

胰蛋白酶活性測定按照文獻(xiàn)[15-16]的方法進(jìn)行，并稍加改動。以BApNA（Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽）為底物，在3.2 mL活性測定體系（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含10 mmol/L CaCl2）中加入0.5 mL待測樣品，37℃預(yù)熱5 min后，加入17 μL底物BApNA（150 mmol/L，溶劑為二甲基亞砜），繼續(xù)保溫10 min后，加入0.5 mL 33%醋酸溶液終止反應(yīng)，在410 nm的波長下測定反應(yīng)體系中由產(chǎn)物對硝基苯胺（PNA）所產(chǎn)生的吸光度?？瞻左w系加樣順序?yàn)橄燃尤敕磻?yīng)終止液33%醋酸，再加入相同體積的樣品溶液。

1.2.5 胰蛋白酶抑制劑活性測定

按Sappasith等[17]的方法進(jìn)行，并略作修改。在2.5 mL活性測定體系（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含10 mmol/L CaCl2）中加入0.5 mL胰蛋白酶（20 mg/mL）和100 μL待測樣品，37℃預(yù)熱5 min后，加入17 μL底物BApNA（150 mmol/L，溶劑為DMSO），持續(xù)保溫10 min后，加入0.5 mL 33%的醋酸溶液終止反應(yīng)，測定410 nm處吸光度。對照組以100 μL待測樣品的溶劑代替待測樣品。按照公式（1）計(jì)算抑制率。

1.2.6 SDS-PAGE電泳

采用SDS-PAGE法鑒定蛋白純度，以低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kDa）為對照，采用4%濃縮膠和15%濃縮膠，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，脫色液為50 mL甲醇、75 mL冰醋酸與875 mL重蒸水的混合液。

1.2.7 蛋白質(zhì)濃度測定

采用福林酚法測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，按照福林酚蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE鑒定BTI

BTI具有很好的耐熱性，破碎菌體后在80℃下加熱30 min，大量熱不穩(wěn)定的雜蛋白變性沉淀。離心后進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析，結(jié)果見圖1。通過對各蛋白峰抑制活性測定發(fā)現(xiàn)蛋白峰1和2無抑制活性，而蛋白峰3（含300 mmol/L咪唑的洗脫液）抑制胰蛋白酶活性很強(qiáng)，為目的蛋白。以低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kDa）為參照，將經(jīng)Superdex G-25脫鹽后的BTI進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見圖2。BTI（泳道1）在電泳圖譜上顯示單一條帶，表明所得BTI純度較高，達(dá)到電泳純。同時(shí)也表明親和層析是一種很高效的純化方法，僅需一次層析便得到了高純度的目的蛋白。

圖1 BTI的親和層析分離

圖2 BTI的SDS-PAGE電泳圖譜

2.2 BTI-瓊脂糖凝膠對胰蛋白酶的吸附作用

BTI-瓊脂糖凝膠與胰蛋白酶的結(jié)合見圖3。如圖3所示，在上樣時(shí)出現(xiàn)了穿透峰1。當(dāng)用pH 3.5的醋酸-醋酸緩沖液洗脫時(shí)，出現(xiàn)了蛋白峰2。以BApNA為底物鑒定胰蛋白酶活性，發(fā)現(xiàn)穿透峰1與洗脫峰2均能催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生明顯黃色產(chǎn)物，具有胰蛋白酶活性。洗脫峰2的出現(xiàn)表明在pH 7.2的平衡緩沖液條件下上樣時(shí)，胰蛋白酶結(jié)合到了BTI-瓊脂糖凝膠上，抑制劑與胰蛋白酶的活性部位以非共價(jià)鍵相互作用形成類似酶-底物的米氏復(fù)合物[18]，在pH 3.5緩沖液條件下這種作用力減弱，胰蛋白酶從柱上洗脫下來。洗脫下來的胰蛋白酶在pH 3.5時(shí)催化活性不受影響。穿透峰1的出現(xiàn)可能是因?yàn)橐鹊鞍酌干蠘恿窟^大，超過了親和柱的吸附容量。

2.3 pH對BTI-Sepharose柱吸附胰蛋白酶的影響

降低胰蛋白酶上樣量為3 mg，將胰蛋白酶與牛血清白蛋白混合樣品上樣于BTI親和層析柱，在pH 7.2的平衡緩沖液條件下上樣，pH 3.5的緩沖液洗脫，純化層析結(jié)果見圖4。上樣與洗脫時(shí)均出現(xiàn)了蛋白峰，表明有一種蛋白在pH 7.2緩沖液的條件下未與親和柱結(jié)合，另一種蛋白在此條件與親和柱結(jié)合，但在pH 3.5緩沖液條件下與柱解離，被洗脫出來。對兩個(gè)蛋白峰進(jìn)行胰蛋白酶活性鑒定，發(fā)現(xiàn)穿透峰沒有胰蛋白酶活性，而洗脫峰有活性，表明穿透峰為牛血清白蛋白，沒有胰蛋白酶，胰蛋白酶全部結(jié)合到親和柱上。SDS-PAGE結(jié)果（圖5）顯示洗脫樣品胰蛋白酶為單一條帶，穿透峰中只有牛血清白蛋白，進(jìn)一步說明BTI-Sepharose柱可以特異結(jié)合胰蛋白酶。

圖3 胰蛋白酶的親和層析分離圖譜

圖4 胰蛋白酶與BSA在pH 7.2平衡條件下的層析圖

圖5 親和層析蛋白峰的SDS-PAGE圖譜

將胰蛋白酶（3 mg）與牛血清白蛋白混合樣品在pH 5.0的平衡緩沖液條件下上樣，收集穿透峰，經(jīng)鑒定穿透峰有胰蛋白酶活性。SDS-PAGE結(jié)果（圖6）顯示穿透峰樣品顯示兩條帶，分別是牛血清白蛋白（BSA）和胰蛋白酶（Trypsin）。胰蛋白酶活性測定與SDS-PAGE結(jié)果均說明在pH 5.0的平衡緩沖液條件下，部分胰蛋白酶未能與BTI-Sepharose柱結(jié)合，吸附效果不好。由于BTI具有很好的pH穩(wěn)定性，胰蛋白酶的最適作用條件為堿性環(huán)境，推測在pH 5.0時(shí)親和柱吸附胰蛋白酶效率下降是由于胰蛋白酶空間構(gòu)象發(fā)生了變化。圖6 胰蛋白酶與BSA在pH 5.0平衡液下穿透峰的SDS-PAGE圖譜

2.4 pH對BTI-Sepharose柱解吸附胰蛋白酶的影響

將胰蛋白酶與牛血清白蛋白混合樣品在pH 7.2的平衡緩沖液條件下上樣，用pH 4.5的醋酸緩沖液（0.2 mol/L）洗脫，純化層析圖譜見圖7。經(jīng)活性檢測發(fā)現(xiàn)穿透峰樣品沒有胰蛋白酶活性，洗脫峰樣品有一定活性（A410為0.075），但活性顯著低于pH 3.5緩沖液的洗脫峰（A410為0.845）。SDS-PAGE（圖8）結(jié)果顯示穿透峰只有牛血清白蛋白條帶，與活性測定結(jié)果一致。洗脫峰有一定胰蛋白酶活性，但SDS-PAGE結(jié)果并未出現(xiàn)酶的條帶，表明洗脫峰中胰蛋白酶含量甚微，因此，洗脫效果不如pH 3.5的緩沖液。在pH 4.5條件下，胰蛋白酶與BTI-Sepharose柱仍有一定的親和力，不能完全從柱上解吸，pH 4.5的緩沖液只能將一小部分與BTI結(jié)合不牢固的胰蛋白酶洗脫下來。

圖7 在pH 4.5洗脫條件下胰蛋白酶與BSA的層析分離圖譜

圖8 在pH 4.5洗脫條件下樣品的SDS-PAGE圖譜

3 結(jié)果與討論

通過原核表達(dá)、Ni2+親和柱層析和Superdex G-25凝膠過濾層析技術(shù)分離純化得到電泳純的BTI，與CNBr-Sepharose載體偶聯(lián)制備出親和吸附劑BTI- Sepharose，可用于純化胰蛋白酶。結(jié)果表明，所制備的BTI-Sepharose對胰蛋白酶具有良好的特異吸附性能，BTI-Sepharose與胰蛋白酶的吸附及解吸附作用受到緩沖液pH的影響。二者吸附的最適pH為7.2，緩沖液pH為3.5時(shí)能有效將柱上吸附的胰蛋白酶洗脫。試驗(yàn)制備的BTI-Sepharose親和柱能夠?qū)⒁鹊鞍酌概c牛血清白蛋白的混合物分離且不降低原有酶的生物活性，實(shí)現(xiàn)了簡單、快速、高效一步純化胰蛋白酶的目的。

目前制備胰蛋白酶的方法常以動物胰臟為原材料，采用傳統(tǒng)的鹽析、沉淀結(jié)合超濾、分子篩層析、離子交換層析、疏水層析等技術(shù)。胰臟中大多數(shù)酶以酶原非活性的形式存在，經(jīng)胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，然而動物胰臟中大部分的酶為絲氨酸蛋白酶家族，其中糜蛋白酶與胰蛋白酶的理化性質(zhì)相近，難以將二者分離。傳統(tǒng)方法純化效率低、往往需要多種介質(zhì)與多個(gè)步驟組合才能達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量要求，難以形成產(chǎn)業(yè)化。親和層析利用蛋白質(zhì)等生物大分子間的相互作用力，與配體特異、可逆地結(jié)合在一起，從復(fù)雜的生物樣品中分離得到目標(biāo)產(chǎn)物，與其他方法相比較，特異性高，純化效率高，適合含量少、雜質(zhì)多的物質(zhì)的分離純化，具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的條件[19]。目前雖然有牛和豬來源的胰蛋白酶已經(jīng)商業(yè)化，然而胰蛋白酶在自然界很多物種中普遍存在，其性質(zhì)不盡相同，可用于不同領(lǐng)域。如哺乳動物來源的胰蛋白酶最適作用溫度多為50℃左右，在低溫（如低于20℃）時(shí)活性較低，而某些深海生物來源的胰酶最適作用溫度為20℃左右。在某些技術(shù)領(lǐng)域，如食品或藥品加工制造領(lǐng)域，需要低溫催化，可減少熱能消耗、更多地保留熱敏營養(yǎng)成分或減少副產(chǎn)物的生成等[20]。此次試驗(yàn)制備了胰蛋白酶親和材料，有望分離得到更多未知胰蛋白酶類，開拓新型酶的研究與應(yīng)用，具有巨大的科研意義和市場前景。