高超

關(guān)鍵詞：款冬葉;黃酮;衰老模型小鼠;抗氧化活性

摘要：采用超聲波輔助提取款冬葉黃酮，利用吸附樹脂對其進(jìn)行純化，進(jìn)而探討款冬葉黃酮體外抗氧化活性（DPPH+·清除力和Fe3+還原力）及其對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化活性（T-AOC，SOD活性，GSH-PX活性和MDA含量）的影響.結(jié)果表明：款冬葉黃酮具有良好的抗氧化活性，可提高DPPH+·清除力和Fe3+還原力，并可顯著提高亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)的T-AOC，SOD活性和GSH-PX活性，降低 MDA 含量.款冬葉黃酮良好的抗氧化活性可應(yīng)用于抗衰老產(chǎn)品的研究，為我國中草藥活性成分的提取與應(yīng)用提供參考.

Abstract：Using ultrasonic auxiliary to extract coltsfoot leaf flavonoid，and to purify it by adsorption resin，coltsfoot leaf flavonoid in vitro antioxidant activity （DPPH+· scavenging force and Fe3+ reducing force） and its influence on antioxidant activity of subacute aging model mice （T-AOC，SOD activity，GSH-PX activity and MDA content） were explored.The results showed that the coltsfoot leaf flavonoid had good antioxidant activity，and they could improve the Fe3+ reducing force and DPPH+· scavenging force，and obviously improve the T-AOC，SOD and GSH-PX activity of the subacute aging model mice and reduce MDA content.

0 前言

款冬（Tussilago farfara L.），別名冬花、蜂斗菜，是菊科款冬屬多年生草本植物[1]，全屬僅一種.款冬含有黃酮類、萜類、生物堿、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖等活性成分，具有鎮(zhèn)咳祛痰、保護(hù)心血管、影響興奮呼吸中樞、抗血小板聚集、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎等生理功能[2-3].黃酮類化合物是母核結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮的多酚類化合物[4]，作為一種有效的活性物質(zhì)廣泛分布在各種植物中.目前，已報道的黃酮類物質(zhì)具有保護(hù)酒精性肝損傷小鼠、抗腫瘤、抗癌、降血脂、治療糖尿病、調(diào)節(jié)免疫、抑菌、抗病毒、抗氧化等方面的作用[5-10].我國東北地區(qū)款冬屬植物資源豐富，傳統(tǒng)上使用款冬花入藥，款冬葉莖部分則作為廢棄物處理，資源未能得到合理利用.近年來，對于款冬的研究主要集中在款冬花的成分及其生理活性方面.例如，宋逍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，款冬花多糖具有一定的抗氧化活性，對羥自由基、超氧自由基具有較強(qiáng)的清除力;程曉葉等[12]從款冬花提取物中共鑒定出34種，包括12種萜類化合物、8種黃酮類化合物、7種酚酸類化合物、2種苯并吡喃類化合物、1種苯并呋喃類化合物、1種脂肪酮類化合物和3種生物堿;喬月等[13]研究發(fā)現(xiàn)，款冬花中普遍含有吡咯里西啶生物堿及其氮氧化物，其中以具有顯著肝毒性的克氏千里光堿為主要種類. 然而對于款冬葉黃酮的抗氧化機(jī)制研究尚未見報道.

鑒于此，本研究擬以款冬葉為實驗材料，采用超聲波輔助提取款冬葉黃酮，利用吸附樹脂對其進(jìn)行純化，研究款冬葉黃酮體外抗氧化活性，以及對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響，旨在探究款冬葉黃酮的抗氧化活性，為款冬植物資源的合理利用和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明種小白鼠（SCXK-（吉）2003-0001），體重25 g左右，雌雄各半，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供.

1.2 材料與試劑

NaNO2，Al（NO3）3，HCl，NaOH，F(xiàn)eCl3，Na2CO3，鐵氰化鉀，三氯乙酸，石油醚，無水乙醇，正丁醇，甲醇，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），均為分析純，北京化工有限公司產(chǎn);SP-825大孔吸附樹脂，東鴻化工有限公司產(chǎn);羧甲基纖維素鈉（食品級）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海析明生物科技有限公司產(chǎn);總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、谷胱甘肽過氧化物歧化酶（GSH-PX）試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn).

1.3 儀器與設(shè)備

AUY-220型電子天平，島津國際貿(mào)易有限公司產(chǎn);TY92-Ⅱ型超微粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技公司產(chǎn);索氏提取器（1000 mL），通化師范學(xué)院實驗室組裝;KQ-250B型超聲波清洗器，東京理化器械株式會社產(chǎn);層析柱（直徑3 cm），海辰喬生物科技有限公司產(chǎn);SP-722E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn);DX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn);Milli-Q型超純水系統(tǒng)，法國Millipore公司產(chǎn);U410型超低溫冰柜，美國NBS公司產(chǎn);GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn);WD-2102型自動酶標(biāo)儀，北京市六一儀器廠產(chǎn).

1.4 實驗方法

1.4.1 款冬葉黃酮的提取

精確稱量款冬葉粉末1.0 g，于80 ℃條件下使用石油醚脫脂3 h.烘干后加30 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，于 60 ℃條件下超聲波輔助提取20 min，抽濾留濾液，減壓回收乙醇至濾液為2 mL左右為止.正丁醇水飽和溶液萃取 2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 2 mL，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容至100 mL，加體積分?jǐn)?shù)為1%的活性炭進(jìn)行脫色處理.再于4 ℃條件下醇沉24 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至25 mL，即得待測液.將待測液冷凍干燥處理后，即得款冬葉黃酮粗提物，其得率的計算公式為得率=款冬葉黃酮粗提物質(zhì)量款冬葉粉末質(zhì)量×100%

1.4.2 款冬葉黃酮的純化

按1.4.1方法得到款冬葉黃酮粗提物，采用丁彩麗等[14]的方法進(jìn)行純化處理.純化條件為：選擇SP-825大孔吸附樹脂，pH值為3～4，使用恒流泵控制流量，以2 BV/h的流速進(jìn)行吸附，最大上樣量為44倍樹脂體積，用3 BV體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液以1～2 BV/h的流速進(jìn)行洗脫.將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥后，即得純化后的款冬葉黃酮粉末.款冬葉黃酮純度計算公式為純度=款冬葉黃酮粉末質(zhì)量款冬葉黃酮粗提物質(zhì)量×100%

1.4.3 款冬葉黃酮體外抗氧化活性實驗

1.4.3.1 DPPH+·清除力測定

將4.0 mL不同質(zhì)量濃度（分別為0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL，1.0 mg/mL，1.2 mg/mL）的款冬葉黃酮樣品溶液和1.0 mL濃度為 1 mol/L 的 DPPH溶液混勻，室溫下避光反應(yīng) 30 min，即得反應(yīng)液，并于517 nm處測定其吸光度值.以無水乙醇作空白對照，并對照款冬葉黃酮樣品溶液，采用相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作陽性對照[15].按以下公式計算DPPH+·清除率.

其中，Y為DPPH+·清除率/%，Ai為反應(yīng)液吸光度值，Ax為款冬葉黃酮樣品溶液吸光度值，A0為空白對照吸光度值.DPPH+·清除率越大，則DPPH+·清除力越強(qiáng)，即體外抗氧化活性越強(qiáng).

1.4.3.2 Fe3+還原力測定

采用普魯士藍(lán)法[16]，在2.0 mL 濃度為0.2 mol/L且 pH 值為6.6 的磷酸鹽緩沖液中，加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度（0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL，1.0 mg/mL，1.2 mg/mL）的款冬葉黃酮樣品溶液，再加入2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1% 的鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴鍋中恒溫水浴30 min，經(jīng)流水冷卻后，加入2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的三氯乙酸溶液后終止反應(yīng)，即得反應(yīng)液.取2.0 mL反應(yīng)液，加入2.0 mL蒸餾水和 1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1%的FeCl3溶液，搖勻，于700 nm處測定其吸光度值.吸光度值增加，表明還原力增強(qiáng).以蒸餾水作空白對照，并對照款冬葉黃酮樣品溶液，采用相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作陽性對照.Fe3+還原力越強(qiáng)，則體外抗氧化活性越強(qiáng).

1.4.4 款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響研究

1.4.4.1 實驗動物分組與模型建立

選用健康的昆明種小白鼠，適應(yīng)環(huán)境7 d后，隨機(jī)分組，每組10只（雌雄各5只），共6組（空白對照組，模型對照組，款冬葉黃酮高、中、低劑量組，陽性對照組）.在空調(diào)動物房（18～22 ℃）內(nèi)，雌雄分籠，分組飼喂基礎(chǔ)飼料，自由攝食，自然采光.建模階段，除空白對照組外，其余各實驗小組以300 mg/（kg·d）的劑量皮下注射D-半乳糖，空白對照組注射同劑量生理鹽水，1次/d，持續(xù)7周，構(gòu)建D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型.建模成功后，模型對照組和空白對照組以100 mg/（kg·d）的劑量灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，陽性對照組以 200 mg/（kg·d）的劑量灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.02% 的Vc溶液，款冬葉黃酮低、中、高劑量組分別以50 mg/（kg·d），100 mg/（kg·d），200 mg/（kg·d）的劑量灌胃溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5% 的羧甲基纖維素鈉溶液的款冬葉黃酮.各組均連續(xù)灌胃28 d.

1.4.4.2 小鼠體內(nèi)抗氧化指標(biāo)的測定

按照試劑盒說明書，測定各實驗組小鼠血清、肝組織、腦組織和心臟組織中的T-AOC， SOD活性， GSH-PX活性和MDA含量.

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)，單一樣本組間比較平均值，作方差分析后使用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）表示數(shù)據(jù)結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 款冬葉黃酮提取與純化結(jié)果

本實驗每g款冬葉中黃酮粗提物質(zhì)量為71.8 mg，其得率為7.18%.經(jīng)純化處理后，款冬葉黃酮純度為63.2%.

2.2 款冬葉黃酮體外抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH+·清除力分析

款冬葉黃酮對DPPH+·清除率的影響如圖1所示.從圖1可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，款冬葉黃酮和Vc對 DPPH+·的清除率逐漸增大，即二者的DPPH+·清除力逐漸增強(qiáng).當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL和0.4 mg/mL時，Vc對 DPPH+·的清除率較高;當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL和 0.8 mg/mL時，款冬葉黃酮和Vc對DPPH+·的清除率基本保持一致;持續(xù)增大樣品質(zhì)量濃度，款冬葉黃酮對DPPH+·的清除率則強(qiáng)于Vc.這表明當(dāng)款冬葉黃酮質(zhì)量濃度大于1.0 mg/mL 時，其具有較強(qiáng)的DPPH+·清除力.

2.2.2 Fe3+還原力分析

款冬葉黃酮對Fe3+還原力的影響如圖2所示.從圖2可以看出，款冬葉黃酮和Vc對Fe3+的還原力與劑量呈正相關(guān)，即樣品質(zhì)量濃度越大，F(xiàn)e3+還原力越強(qiáng).當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時，Vc對Fe3+的還原力強(qiáng)于款冬葉黃酮;當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時，款冬葉黃酮和Vc對Fe3+的還原力基本相當(dāng);當(dāng)樣品質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL時，款冬葉黃酮對Fe3+的還原力急速上升并顯著強(qiáng)于Vc.這表明當(dāng)款冬葉黃酮質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL時，其具有較強(qiáng)的Fe3+還原力.

體外抗氧化實驗結(jié)果表明，款冬葉黃酮可提高DPPH+·清除力和Fe3+還原力，當(dāng)質(zhì)量濃度大于1.0 mg/mL時，款冬葉黃酮對DPPH+·的清除力和對Fe3+的還原力均強(qiáng)于Vc，且當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，款冬葉黃酮對DPPH+·的清除力和對Fe3+的還原力最強(qiáng)，這說明較高質(zhì)量濃度的款冬葉黃酮體外抗氧化活性較強(qiáng)，這一結(jié)論與其他植物黃酮的抗氧化活性研究[17]的結(jié)果一致.

2.3 款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響分析

2.3.1 款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)T-AOC的影響

款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)T-AOC的影響如表1所示.由表1可知，模型對照組小鼠血清、腦組織、肝臟組織和心臟組織的T-AOC均低于空白對照組，且小鼠血清、肝臟組織和心臟組織的T-AOC組間差異極顯著（P<0.01），說明亞急性衰老模型小鼠建模成功.與模型對照組相比，款冬葉黃酮各劑量組和陽性對照組小鼠血清中的 T-AOC 均有不同程度的提高，且小鼠腦組織、肝臟組織和心臟組織的T-AOC組間均差異顯著（P<0.05）.這表明款冬葉黃酮能不同程度地提高亞急性衰老模型小鼠血清、肝臟組織、腦組織和心臟組織的 T-AOC，且款冬葉黃酮中、高劑量組對亞急性衰老模型小鼠血清中的 T-AOC 作用效果均強(qiáng)于陽性對照組.

2.3.2 款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)SOD活性的影響

款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)SOD活性的影響如表2所示.由表2可知，模型對照組小鼠血清、腦組織、肝臟組織和心臟組織中的SOD活性均低于空白對照組，且各指標(biāo)均差異極顯著（P<0.01），說明亞急性衰老模型小鼠建模成功.與模型對照組相比，款冬葉黃酮高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠血清、肝臟組織、腦組織和心臟組織中的SOD活性均有不同程度的提高，且款冬葉黃酮中、高劑量組小鼠血清、肝臟組織、腦組織和心臟組織的SOD活性差異極顯著（P<0.01）.這表明款冬葉黃酮能顯著提高小鼠血清、肝臟組織、腦組織和心臟組織的SOD活性，且除肝臟組織外，款冬葉黃酮中、高劑量組的作用效果均強(qiáng)于陽性對照組.

2.3.3 款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)GSH-PX活性的影響

款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)GSH-PX活性的影響如表3所示.由表3可知，模型對照組小鼠血清、腦組織、肝臟組織和心臟組織中的GSH-PX活性均低于空白對照組，且各指標(biāo)差異極顯著（P<0.01），說明亞急性衰老模型小鼠建模成功.與模型對照組相比，款冬葉黃酮各劑量組小鼠血清和各組織中的GSH-PX活性均有所提高，且差異極顯著（P<0.01）;陽性對照組小鼠血清、腦組織、心臟組織中的GSH-PX活性均差異極顯著（P<0.01）.對于款冬葉黃酮中、高劑量組，小鼠血清、肝臟組織、腦組織和心臟組織中的GSH-PX活性均高于陽性對照組.

2.3.4 款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)MDA含量的影響

款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)MDA含量的影響如表4所示.由表4可知，與空白對照組相比，模型對照組小鼠血清、腦組織、肝臟組織和心臟組織中的MDA含量均有所提高，且差異極顯著（P<0.01），說明亞急性衰老模型小鼠建模成功.款冬葉黃酮高、中、低劑量組和陽性對照組的MDA含量均低于模型對照組，且差異極顯著（P<0.01），說明款冬葉黃酮能顯著降低衰老模型小鼠血清、肝臟組織、腦組織和心臟組織中的MDA含量，且作用顯著.款冬葉黃酮高劑量組對小鼠腦組織和心臟組織中的抗氧化作用效果強(qiáng)于陽性對照組.

3 結(jié)論

本文以款冬葉為實驗材料，采用超聲波輔助提取款冬葉黃酮，利用吸附樹脂對其進(jìn)行純化，進(jìn)而考察了款冬葉黃酮體外抗氧化活性（DPPH+·清除力和Fe3+還原力）.同時，構(gòu)建了亞急性衰老模型小鼠，研究了款冬葉黃酮對亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化活性（T-AOC，SOD活性，GSH-PX活性和MDA含量）的影響.

結(jié)果表明：款冬葉黃酮可提高DPPH+·清除力和Fe3+還原力，且較高質(zhì)量濃度的款冬葉黃酮體外抗氧化活性較強(qiáng);款冬葉黃酮具有良好的體內(nèi)抗氧化活性，可顯著提高亞急性衰老模型小鼠體內(nèi)的 T-AOC，SOD活性和GSH-PX活性，降低 MDA含量.該研究結(jié)果有助于促進(jìn)款冬葉黃酮良好的抗氧化活性在抗衰老方面的應(yīng)用研究，可使款冬植物資源得到更合理的利用，為我國中草藥活性成分的提取和應(yīng)用提供參考.

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉毅，王允，萬德光，等.款冬花本草考證[J].中藥材，2010，33（4）：634.

[2] 劉佳，孫國強(qiáng)，秦夢，等.款冬花的本草考證[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2018，35（2）：204.

[3] 劉玉峰，楊秀偉，武濱.款冬花化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志，2007，32（22）：2378.

[4] 朱丹，袁芳，孟坤，等.黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（6）：387.

[5] 梁樹才，宗自衛(wèi)，于海英，等.荷葉總黃酮對小鼠酒精肝損傷的保護(hù)作用[J].食品工業(yè)科技，2014，35（9）：347.

[6] 任虹，張乃元，田文靜，等.源于果蔬的黃酮類化合物及其抗腫瘤作用靶點研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2013，34（11）：321.

[7] 曾佑煒.黃酮抗癌作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016（11）：1838.

[8] 盧秋玉，陳曉宇，申慶榮，等.木棉花總黃酮降血脂作用及其機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2016（1）：88.

[9] 李淑珍，李進(jìn).黑果枸杞總黃酮降血脂作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（5）：1072.

[10]李鵬程，樸春紅，張嵐，等.蕎麥殼黃酮提取物對2型糖尿病大鼠的血糖改善作用及機(jī)制[J].食品科學(xué)，2017，38（5）：244.

[11]宋逍， 段璽， 唐志書，等. 微波輔助提取款冬花多糖的工藝及抗氧化活性研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新， 2016（23）：27.

[12]程曉葉，張霞，廖曼，等.UPLC-Q-TOF-MS法分析款冬花的化學(xué)成分[J].中草藥，2017（12）：2390.

[13]喬月，陳麗華，胡宏秀，等.基于UPLC-MS/MS同時測定款冬花中吡咯里西啶生物堿及其氮氧化物的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志， 2016（1）：155.

[14]丁彩麗，吳鳴建，程向紅，等.SP825大孔吸附樹脂純化款冬花中總黃酮的研究[J].食品科技，2009，34（6）：220.

[15]CENH Z，BERTIN R，F(xiàn)ROLDI G.EC50 estimation of antioxidant activity in DPPH· assay using several statistical programs[J].Food Chemistry，2013，138（1）：414.

[16]MA Z，HUANG T，LI Y，et al.Study on antioxidant activity in vitro of methanol extract of jasminum sambac leaves[J].Chinese Wild Plant Resources，2015，34（3）：20.

[17]丁豪，楊海燕，辛志宏.昆侖雪菊黃酮類化合物的抗氧化相互作用研究[J].食品科學(xué)，2015，21：26.