王文義 檀興慧 張萍萍 楊宇珂 黃梓泓 李德森 吳水生

摘 要 目的：探討鉤吻總堿（TAG）抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及血管新生的作用。方法：體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），經(jīng)低、中、高劑量TAG（40、80、120 μg/mL）干預(yù)后，使用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察兩種細(xì)胞的形態(tài)，采用CCK-8法檢測(cè)兩種細(xì)胞的存活率，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT-29細(xì)胞的周期變化情況，采用劃痕試驗(yàn)、Transwell侵襲試驗(yàn)和管腔形成試驗(yàn)檢測(cè)HUVEC的遷移率、侵襲率和管腔數(shù)量。結(jié)果：與空白組比較，TAG各劑量組HT-29細(xì)胞和HUVEC均有不同程度的減少，并可見(jiàn)死亡細(xì)胞，兩者存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;TAG各劑量組G2/M期HT-29細(xì)胞比例以及中劑量組G0/G1期細(xì)胞比例均顯著升高，而TAG各劑量組S期細(xì)胞比例以及高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;TAG各劑量組HUVEC的存活率、遷移率、侵襲率均顯著降低，4～24 h各時(shí)間點(diǎn)管腔數(shù)量均顯著減少（P<0.01）。結(jié)論：TAG可抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞和HUVEC的增殖，可改變HT-29細(xì)胞的周期，并抑制HUVEC的遷移、侵襲及管腔形成。

關(guān)鍵詞 鉤吻總堿;結(jié)腸癌;HT-29細(xì)胞;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;增殖;遷移;侵襲;血管新生

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the inhibitory effects of total alkaloids of Gelsemium elegans （TAG） on the proliferation and angiogenesis of human colon cancer cells. METHODS： Human colon cancer cell line HT-29 and HUVEC were cultured in vitro. After the intervention of low-， medium-， high-dose TAG （40， 80， 120 μg/mL）， the morphology of the two cells was observed by fluorescence inversion microscope. The survival rate of HT-29 cells and HUVEC was detected by CCK-8 assay. Flow cytometry was used to detect HT-29 cell cycle. The migration rate， invasion rate and tube number of HUVEC were observed by scratching test， Transwell invasion experiment and tube formation experiment. RESULTS： Compared with blank group， HT-29 cells and HUVEC were decreased to different extents in TAG groups; dead cells were observed， and the survival rate of both decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The proportion of HT-29 cells at G2/M phase in TAG groups as well as those at G0/G1 phase in medium-dose group were increased significantly; the proportion of HT-29 cells at S phase in TAG groups as well as those at G0/G1 phase in high-dose group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Survival rate， migration rate and invasion rate of HUVEC were decreased significantly in TAG groups， and tube number was also decreased significantly at each time point during 4-24 h （P<0.01）. CONCLUSIONS： TAG have inhibitory effect on the proliferation of human colon cancer HT-29 cells and HUVEC， can change HT-29 cell cycle， inhibit the migration， invasion and tube formation of HUVEC.

KEYWORDS? ?Total alkaloid of Gelsemium elegans; Colon cancer; HT-29 cells; HUVEC; Proliferation; Migration; Invasion; Angiogenesis

結(jié)腸癌（Colon cancer，CRC）是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，2018年全球CRC患者病死率和發(fā)病率分別位列惡性腫瘤的第2、3位[1]，且目前仍無(wú)有效防治CRC的措施。中藥防治CRC具有低毒、有效的特點(diǎn)，有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值[2-4]。鉤吻[Gelsemium elegans（Gardn. et Champ.）Benth.]為馬錢(qián)科胡蔓藤屬植物，又名斷腸草、大茶藥、野葛以及胡蔓藤等，其具有良好的抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理活性，在腫瘤患者鎮(zhèn)痛和肝癌患者生存期延長(zhǎng)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[5-7]。鉤吻總堿（TAG）是鉤吻的主要成分之一，其既為活性成分，也是毒性成分。本課題組前期研究表明，TAG能抑制CRC細(xì)胞的增殖，并可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的增殖與遷移，但具體作用及其機(jī)制尚不明確[8-10]。有研究指出，腫瘤細(xì)胞的存活與增殖依賴(lài)于血管生成[11]，而鉤吻及其活性成分能否影響CRC細(xì)胞的血管生成、且通過(guò)何種形式調(diào)控這一個(gè)過(guò)程，尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。鑒于鉤吻對(duì)CRC細(xì)胞的抑制活性，本研究初步探討了TAG在CRC血管生成中的作用及可能機(jī)制，旨在為鉤吻及其活性成分在CRC臨床治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HF212 UV型CO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）;Multiskan FC型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司];FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）;IX70型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;TDZ4A-WS型低速水平離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鉤吻藥材購(gòu)自福建省龍巖市胡蔓藤種植基地，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒定為鉤吻真品。TAG凍干粉由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室制備（得率為0.6%）。

0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：2048080）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：1982158C）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號(hào)：8119049）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)：8119022）、青鏈霉素（批號(hào)：2019313）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;McCoys 5A培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190212）;CCK-8試劑盒（美國(guó)MCE公司，批號(hào)：30116）;碘化丙啶/核糖核酸酶（PI/RNase）染料（美國(guó)BD公司，批號(hào)：9039585）;Triton X-100試劑[愛(ài)必信（上海）生物科技有限公司，批號(hào)：J02N];結(jié)晶紫試劑（批號(hào)：1130P041）、Matrigel基質(zhì)膠（批號(hào)：20190218）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人CRC HT-29細(xì)胞、HUVEC均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 藥液配制

取TAG凍干粉100 mg，溶于DMSO 4 mL中，配成質(zhì)量濃度為25 mg/mL的TAG母液，于4 ℃保存，備用。臨用前用McCoys 5A完全培養(yǎng)基或RPMI 1640完全培養(yǎng)基（即含有10%FBS、1%青鏈霉素的McCoys 5A培養(yǎng)基或RPMI 1640培養(yǎng)基）稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HT-29細(xì)胞和HUVEC分別接種至含McCoys 5A完全培養(yǎng)基和RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察

使用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞、HUVEC各適量，經(jīng)含EDTA的胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)后，以1.0×105個(gè)/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至50%～60%后，將其隨機(jī)分為空白組和TAG低、中、高劑量組[40、80、120 μg/mL，劑量參考已有文獻(xiàn)和TAG半數(shù)抑制濃度（IC50）[8，10]設(shè)置，下同]，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，空白組加入相應(yīng)完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)24 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍攝細(xì)胞形態(tài)。

2.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞、HUVEC各適量，經(jīng)含EDTA的胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)后，以1.0×105個(gè)/mL按每孔100 μL接種至96孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至50%～60%后，將其隨機(jī)分為空白組、DMSO組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，空白組加入相應(yīng)完全培養(yǎng)基100 μL，DMSO組加入含DMSO 0.5 μL的完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑10 μL，避光培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率=（空白組平均OD值-試驗(yàn)組平均OD值）/空白組平均OD值×100%。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 HT-29細(xì)胞周期變化檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞適量，經(jīng)不含EDTA的胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)后，以1.0×105個(gè)/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至50%～60%后，將其隨機(jī)分為空白組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，空白組加入McCoys 5A完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的McCoys 5A完全培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，收集細(xì)胞，用4 ℃ PBS清洗后，置于70%乙醇中，于-20 ℃固定過(guò)夜，以1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用PBS清洗后，加入含0.2%Triton X-100試劑的PI/RNase染料0.5 mL，避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況并使用Modfit 5.0周期擬合軟件進(jìn)行分析。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 HUVEC遷移能力檢測(cè)

采用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC適量，經(jīng)含EDTA的胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)后，以1×105個(gè)/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)后，用200 μL槍頭在每孔底部中央作一劃痕，用PBS清洗后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，空白組加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640完全培養(yǎng)基2 mL。分別于培養(yǎng)的0、24 h時(shí)拍照，并使用Image Pro-Plus 6.0軟件分析結(jié)果，計(jì)算遷移率：遷移率=（0 h時(shí)遷移距離-24 h時(shí)遷移距離）/0 h時(shí)遷移距離×100%。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 HUVEC侵襲能力檢測(cè)

采用Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC適量，經(jīng)含EDTA的胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)后，以1×105個(gè)/mL按每孔2 mL接種至6孔板中，將其隨機(jī)分為空白組和TAG低、中、高劑量組（40、80、120 μg/mL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，空白組于小室上層加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基200 μL，各給藥組于小室上層加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640完全培養(yǎng)基200 μL，各組均于小室下層加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基700 μL。培養(yǎng)24 h，棄去上清液，用棉簽擦拭上層底部未穿膜的細(xì)胞，用PBS清洗，以多聚甲醛溶液固定20 min后，加結(jié)晶紫試劑染色15 min，用PBS清洗，使用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，拍照并記錄染色細(xì)胞（染色后呈紫紅色的細(xì)胞即為發(fā)生遷移的細(xì)胞）數(shù)，同時(shí)計(jì)算侵襲率：侵襲率=試驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/空白組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。