徐燕，蔣衛(wèi)平，蔣慧玲，史楊，程慧斐，黃桂英，裴立紅，周麗紅

（麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水 323000）

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒感染是宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的主要原因，同時宿主因素也起著重要作用，即不同的群體和個體對宮頸鱗狀細(xì)胞癌的易感性存在差異。宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險與某些基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）相關(guān)[1-2]，X-射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因 1（X-ray repair cross complementing group1，XRCC1）是一種重要的DNA修復(fù)基因，在DNA堿基切除修復(fù)途徑（BER）中起重要作用[3-4]。以往對麗水地區(qū)婦女HPV感染流行病學(xué)調(diào)查顯示，本地區(qū)患者最常見的高危型HPV為16、18、52和58型[5]。為此，作者在本地區(qū)進(jìn)行XRCC1基因Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln單核苷酸多態(tài)性與 HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年5月-2019年7月本院住院治療的高危型 HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細(xì)胞癌115例（宮頸鱗狀細(xì)胞癌組），所有病例均經(jīng)組織病理證實(shí)為宮頸鱗狀細(xì)胞癌，經(jīng)HPV分型檢測為四個型別的單一或混合感染。同期選擇本院體檢的婦女143例（對照組），經(jīng)HPV分型檢測均為陰性，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）診斷為未見上皮內(nèi)病變及惡性細(xì)胞（NILM）或良性反應(yīng)性細(xì)胞改變（炎癥）。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組年齡（52.8±9.2）歲，對照組年齡（53.1±8.9）歲，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有血液標(biāo)本均成功進(jìn)行了基因型分型，所有宮頸分泌物標(biāo)本成功進(jìn)行了HPV分型。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組和對照組XRCC1基因Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln三個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。受試者均為麗水籍并簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法 所有受試者均采集宮頸分泌物和靜脈血，宮頸分泌物用專用細(xì)胞保存液保存，靜脈血用EDTA-K2抗凝，受試標(biāo)本的所有項目當(dāng)天完成檢測。

1.2.1 HPV分型檢測 采用廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司產(chǎn)品，該試劑運(yùn)用PCR-反向點(diǎn)雜交法，具體為針對人乳頭瘤病毒基因組晚期區(qū)L1區(qū)設(shè)計特異性引物和28型探針，并將特異性探針包被在尼龍膜上，再通過生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行靶片斷擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物和膜條上的特異性探針雜交，通過雜交、洗膜，靶標(biāo)中的型特異性片斷會和特異性探針結(jié)合，最后進(jìn)顯色，并進(jìn)行結(jié)果分析，從而檢測出人乳頭瘤病毒28種基因型DNA，包括：15種高危型別：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82（MM4）；3 種疑似高危型別：26、53、66；10 種低危型別：6、11、40、42、43、44、54、61、81（cp8304）、83（MM7）。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測 （1）核酸提取或純化。采用江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，該試劑運(yùn)用柱式提取法，具體為樣本經(jīng)蛋白酶K結(jié)合、裂解后，DNA特異性結(jié)合到Spin Columns柱上，污染物經(jīng)離心丟棄，PCR抑制劑可通過兩步有效的洗滌被完全去除，結(jié)合在離心柱上的核酸可用洗脫液洗脫，得到純化的DNA，基因組DNA要求：經(jīng)紫外分光光度計檢測260/280≥1.7，260/230≥1.5，純度5-10ng/μL。（2）XRCC1 多態(tài)性檢測。采用美國 ABI公司產(chǎn)品，貨號4351379，該試劑運(yùn)用實(shí)時熒光PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，針對XRCC1Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln三個位點(diǎn)設(shè)計引物和探針，在194-Trp、280-His、399-Gln的探針上標(biāo)記FAM熒光素，在194-Arg、280-Arg、399-Arg的探針上標(biāo)記 VIC 熒光素，通過實(shí)時熒光PCR分析其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphims，SNP）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Haploview4.2進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗，計量資料比較采用t檢驗，兩組間基因多態(tài)性分布比較采用χ2檢驗，以非條件Logistic回歸方法計算相對風(fēng)險度的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）。

2 結(jié)果

2.1 SNP基因位點(diǎn)信息 作者通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1799782查詢到XRCC1中的rs1799782基因多態(tài)性位點(diǎn)，580C>T表示在第580個堿基位置中編碼精氨酸（Arg）的密碼子CGG中的第一個堿基C突變成T形成編碼色氨酸（Trp）的密碼子TGG，編碼的氨基酸位置為第194個，表示為Arg194Trp；通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs25489查詢到XRCC1中的rs25489基因多態(tài)性位點(diǎn)，839G>A表示在第839個堿基位置中編碼精氨酸（Arg）的密碼子CGT中的第二個堿基G突變成A形成編碼組氨酸（His）的密碼子CAT，編碼的氨基酸位置為第280個，表示為Arg280His；同理，通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs25487查詢到XRCC1中的rs25487基因多態(tài)性位點(diǎn)，1196G>A表示第1196個堿基位置中編碼精氨酸（Arg）的密碼子CGG中的第二個堿基G突變成A形成編碼谷氨酰胺（Gln）的密碼子CAG，編碼的氨基酸位置為第399個，表示為Arg399Gln。

2.2 HPV基因型分布 對照組143例HPV檢測均為陰性，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組115例HPV檢測均為陽性，基因型分布具體情況詳見表1，其中31例同時感染其他型別的HPV。

表1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組感染HPV基因型分布（n=115）

2.3 Hardy-Weinberg平衡分析 HWE軟件檢測結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組和對照組XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。詳見表2-4。

表2 XRCC1-Arg194Trp基因型和等位基因分布頻率

表3 XRCC1-Arg280His基因型和等位基因分布頻率

表4 XRCC1-Arg399Gln基因型和等位基因分布頻率

2.4 XRCC1基因型和等位基因頻率分布 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組和對照組XRCC1-Arg194Trp和Arg399Gln基因型和等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），宮頸鱗狀細(xì)胞癌組和對照組XRCC1-Arg280His基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表 2-4。

2.5 XRCC1-Arg194Trp、Arg280His 和 Arg399Gln基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系 XRCC1-Arg194Trp多態(tài)性位點(diǎn)中，攜帶Trp基因的個體HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險是 Arg個體的 1.793 倍（OR=1.793，95%CI=1.190～2.702，P＜0.05）；XRCC1-Arg399Gln 多態(tài)性位點(diǎn)中，攜帶 Gln 基因的個體 HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險是Arg個體的1.668倍（OR=1.668，95%CI=1.126～2.472，P＜0.05）； 而 XRCC1-Arg280His 的多態(tài)性位點(diǎn)與 HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險無關(guān)（OR=1.210，95%CI=0.753～1.945，P＞0.05）。 詳見表 5。

表5 Logistic回歸分析

3 討論

XRCC1是主要的堿基切除修復(fù)基因，定位于人19號染色體的長臂 （19q13.2-13.3），大小為33kb，包含17個外顯子[3]。XRCCI編碼的蛋白質(zhì)共有3個功能域，在DNA損傷修復(fù)過程中分別和不同的酶相互作用，參與DNA修復(fù)反應(yīng)中的堿基切除修復(fù)和單鏈斷裂修復(fù)[3-4]，對維持機(jī)體的遺傳穩(wěn)定性起著重要作用。XRCC1基因有60多個多態(tài)性位點(diǎn)，出現(xiàn)變異頻率最高、研究最多的是保守序列區(qū)的3個多態(tài)性位點(diǎn)，分別是Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln[6]，此3個多態(tài)性位點(diǎn)已成為研究腫瘤易感性及腫瘤治療反應(yīng)性的遺傳性分子指標(biāo)。

本文首次以麗水地區(qū)人群為研究對象，探討了XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和XRCC1-Arg399Gln基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的關(guān)系，兩組樣本3個基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對象具有群體代表性，分別代表了麗水地區(qū)健康婦女和感染 HPV（16、18、52、58）的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者。結(jié)果顯示，Arg194Trp多態(tài)性基因型在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組和對照組中的分布有顯著性差異（P＜0.05），XRCC1 基因Arg194Trp 位點(diǎn)多態(tài)性使宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險增加了1.793倍；而Arg280 His多態(tài)性與本地區(qū)宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險無關(guān)，XRCC1基因Arg399 Gln位點(diǎn)多態(tài)性使宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險增加了1.668倍。

2007年浙江省婦女生殖健康實(shí)驗室（杭州）Huang等[7]對539例宮頸鱗狀細(xì)胞癌和473例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）患者和800例正常女性進(jìn)行了病例對照研究，發(fā)現(xiàn)與Arg399Arg（GG）相比，攜帶純合子Gln399Gln（AA）基因型的受試者宮頸鱗狀細(xì)胞癌風(fēng)險顯著增加2.32倍 （95%CI 1.47-3.65），雜合子 Arg399Gln（GA）基因型也與宮頸鱗狀細(xì)胞癌風(fēng)險顯著增加相關(guān)；調(diào)整后的比值比（OR）為 1.58（95%CI 1.24-2.00）；同樣，與 Arg194Arg（CC）野生型基因型相比，癌癥的風(fēng)險升高與Trp194Trp（TT）相關(guān)（OR：2.09，95%CI：1.45-3.02），而雜合子Arg194Trp（CT）的風(fēng)險不相關(guān)，而 Arg280His多態(tài)性與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險無關(guān)。針對XRCC1全部3個位點(diǎn)的基因多態(tài)性研究，本文結(jié)果與Zhang等[8]的研究結(jié)果較吻合。但查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-12]，發(fā)現(xiàn)在世界范圍內(nèi)多地區(qū)中XRCC1基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系不明確，受民族或種族、地域等的影響，甚至可能得到相反的結(jié)果，故XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln多態(tài)性與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險還有待于進(jìn)一步的研究。

本文運(yùn)用實(shí)時熒光PCR檢測XRCC1-Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln多態(tài)性在麗水地區(qū)宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者與健康女性中的分布頻率，首次闡明了本地區(qū)XRCC1多態(tài)性與宮頸鱗狀細(xì)胞癌易感性之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制及研究宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病的地域性和種族性提供了可參考的分子遺傳學(xué)依據(jù)，也為本地區(qū)宮頸鱗狀細(xì)胞癌高危人群的早期預(yù)防和診斷提供新的思路。