閆 浩，劉瀟瀟，宋紅霞，劉亞琦，于春雪

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

葛根(RadixPuerariae)為豆科植物野葛的干燥根，在解饑退熱、生津、透疹等方面具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。近年來，越來越多的研究表明葛根在抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用，如葛根素對肝癌細(xì)胞的生長具有抑制作用[1]、葛根散對小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞具有抑制作用[2]等，但有關(guān)葛根抗腫瘤機(jī)制的研究并不多見。

系統(tǒng)藥理學(xué)是將生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)等技術(shù)相互融合[3]，揭示疾病與藥物的相互關(guān)系，將“一種藥物一種疾病一個(gè)基因”的思想轉(zhuǎn)變?yōu)椤岸嗷?多靶點(diǎn)-復(fù)雜疾病”的新思想。分子對接是預(yù)測蛋白與配體親和能力和結(jié)合模式的強(qiáng)有力的工具，通過對靶點(diǎn)蛋白與小分子親和能力和結(jié)合模式的預(yù)測[4]，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

基于系統(tǒng)藥理學(xué)和分子對接，作者對葛根在抗腫瘤方面的機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 葛根活性成分的篩選

TCMSP(traditional Chinese medicine systems pharmacology)數(shù)據(jù)庫包括《中華人民共和國藥典》注冊的499種中藥，含有29 384種成分、3 311個(gè)靶標(biāo)和837個(gè)相關(guān)疾病，它為每種化合物提供了藥物藥代動(dòng)力學(xué)信息，是進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的重要工具[5]。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索葛根的相關(guān)參數(shù)，然后查閱文獻(xiàn)[6]并結(jié)合實(shí)際，以DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選葛根的活性成分。

1.2 腫瘤靶點(diǎn)的預(yù)測

首先，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Targets Infomation尋找與候選活性成分相關(guān)的潛在靶點(diǎn)；然后，使用基因卡片(GeneCards)數(shù)據(jù)庫和在線人類孟德爾遺傳(OMIM)數(shù)據(jù)庫，以“tumour”為關(guān)鍵詞檢索腫瘤靶點(diǎn)，并將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索到的有效信息合并，去除重復(fù)項(xiàng)，與葛根活性成分映射，繪制韋恩圖。

1.3 可視化網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

采用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，對各項(xiàng)屬性進(jìn)行設(shè)置，將葛根、活性成分、對應(yīng)靶點(diǎn)、疾病導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系圖，將葛根多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜抗腫瘤機(jī)制清晰呈現(xiàn)。

1.4 靶點(diǎn)蛋白的篩選

將映射交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為Homo sapiens，設(shè)置相互作用分值，下載tsv文件，利用R語言繪制靶點(diǎn)蛋白圖，選取degree值較大的前5個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接。

1.5 分子對接

首先，利用PubChem數(shù)據(jù)庫查找葛根候選活性成分的(二維)三維結(jié)構(gòu)，繪制ChemBio3D結(jié)構(gòu)，使用MM2力場進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化，轉(zhuǎn)存為PDBQT格式備用；再在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中查找蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的5個(gè)靶點(diǎn)蛋白，對原PDB蛋白分子進(jìn)行如下處理：去除水分子、去除復(fù)合配體、蛋白分子加氫；最后，利用Scripps研究所Olson課題組開發(fā)的Autodock Vina軟件將葛根的候選活性成分與5個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接，選擇能量最低的結(jié)合模式利用PyMOL作圖。

1.6 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用Bioconductor進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析，得到葛根抗腫瘤作用的主要功能富集和作用通路。

2 結(jié)果與討論

2.1 類藥性篩選與疾病-藥物靶標(biāo)預(yù)測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到18個(gè)葛根化合物。以DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到16個(gè)葛根活性成分，如表1所示。

表1葛根的活性成分

Tab.1 Active ingredients of Radix Puerariae

2.2 韋恩圖及藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系圖構(gòu)建

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Targets Information，查找到16個(gè)葛根候選活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)共104個(gè)；將這些靶點(diǎn)經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢轉(zhuǎn)化成基因符號格式；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫查找到腫瘤靶點(diǎn)共8 352個(gè)，映射得到97個(gè)交集基因，如圖1所示。

圖1 韋恩圖Fig.1 Venn mapping

采用Cytoscape軟件將葛根、活性成分、疾病以及交集基因進(jìn)行可視化分析，繪制葛根抗腫瘤機(jī)制的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系圖，如圖2所示。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系圖Fig.2 Network of drug-ingredient-target-disease

2.3 靶點(diǎn)蛋白的篩選

將映射交集基因復(fù)制到STRING數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置minimum required interaction score>0.8，同時(shí)設(shè)置隱藏離散的點(diǎn)，下載tsv文件，運(yùn)用R語言處理，得到靶點(diǎn)蛋白，如圖3所示。

從圖3可知，degree值較大的前5個(gè)靶點(diǎn)蛋白分別是：表皮生長因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、白介素6受體(IL6)、核受體輔激活因子(NCOA1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)。

圖3 PPI中的靶點(diǎn)蛋白Fig.3 Target proteins in PPI

2.4 分子對接

利用Autodock Vina軟件，對16個(gè)候選活性成分與degree值較大的5個(gè)靶點(diǎn)蛋白(EGFR、ESR1、IL6、NCOA1、VEGFA)進(jìn)行分子對接，選取結(jié)合能最低的最優(yōu)結(jié)合模式利用PyMOL作圖，如圖4所示。

從圖4可知，胡蘿卜苷(sitogluside)與EGFR的親和能量最低，親和力最強(qiáng)，其占據(jù)了由Lys745、Thr854、Cys797、Asp800、Pro794殘基組成的活性空腔。羽扇豆酮(lupenone)與ESR1的親和力最強(qiáng)，其占據(jù)了由Tyr526、Leu536、Trp383、Asp351、Ala350、Thr347、Leu525、Cys530殘基組成的活性空腔。大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷(daidzein-4,7-diglucoside)與IL6結(jié)合圖中顯示由His105、Gln39、Val93、Pro42、Tyr175、Glu85殘基組成的活性空腔能夠很好地包裹大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷，其7位糖苷上的羥基與Gln39形成氫鍵，4′位糖苷鍵上的羥基與Tyr175、Glu85形成氫鍵。Phe388、Ile397、Leu324、Ala327、Val361、Gln286、Arg364、Leu287、Arg367、Ala368、Phe401構(gòu)成了NCOA1的活性空腔，β-谷甾醇很好地占據(jù)了NCOA1的活性空腔。VEGFA的活性空腔由Gln22、Tyr21、Tyr25、Cys26、Cys102、HSD27、Pro28組成，羽扇豆酮能夠很好地嵌入空腔結(jié)合。

2.5 GO富集分析

利用Bioconductor對葛根PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析，生物過程、細(xì)胞組分、分子功能均設(shè)定pvalueCutoff=0.05、qvalueCutoff=0.05，對前20個(gè)的基因富集繪制條形圖，如圖5所示。

圖4 候選活性成分與靶點(diǎn)蛋白的最優(yōu)結(jié)合模式Fig.4 Optimal binding mode of candidated active ingredients with target proteins

注：P.adjust值的大小代表富集的顯著性；顏色越深，P.adjust值越?。环粗?，顏色越淺，P.adjust值越大。

由圖5a可知，靶點(diǎn)蛋白參與類固醇激素、抗生素、活性氧代謝、氧化應(yīng)激等生物過程；由圖5b可知，靶點(diǎn)蛋白在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、受體復(fù)合物、血漿脂蛋白顆粒、囊泡腔、質(zhì)膜筏等部位均有分布；由圖5c可知，靶點(diǎn)蛋白具有蛋白結(jié)合、類固醇結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。因此可以得出，葛根可能是通過多途徑、多靶點(diǎn)來發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.6 KEGG通路富集分析

利用Bioconductor對PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的靶點(diǎn)蛋白經(jīng)R語言進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)定pvalueCutoff=0.05、qvalueCutoff=0.05，經(jīng)過R程序運(yùn)行之后將其中顯著性最大的20條通路富集結(jié)果繪制條形圖，如圖6所示。

注：縱軸表示通路名稱，橫軸表示靶點(diǎn)蛋白數(shù)；顏色越深，P.adjust值越小；反之，顏色越淺，P.adjust值越大。

由圖6可知：前列腺癌(prostate cancer)、人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、p53信號通路(p53 signaling pathway)這3條信號通路與葛根抗腫瘤關(guān)系最為密切；除此之外，還得到糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、HIF-1信號通路(HIF-1signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、大腸癌(colorectal cancer)、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、蛋白聚糖在癌癥中的信號通路(proteoglycans in cancer)等顯著性較高的17條信號通路，涉及多個(gè)靶點(diǎn)蛋白、多條信號通路。說明葛根抗腫瘤是通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用。

2.7 討論

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出DL≥0.18的葛根活性成分16個(gè)，主要活性成分為胡蘿卜苷、大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷、葛根素、β-谷甾醇、羽扇豆酮等。胡蘿卜苷是一種天然的甾醇類化合物，具有抗腫瘤作用，Lee等[7]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷對人乳腺癌細(xì)胞具有顯著的抑制遷移作用且具有劑量依賴性。大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷能使大鼠乳腺腫瘤的微血管密度下降，有效抑制乳腺腫瘤生長[8]。葛根素具有抑制腫瘤細(xì)胞周期、調(diào)控線粒體途徑、腫瘤細(xì)胞凋亡信號途徑，相關(guān)研究還表明葛根素純品以及葛根粗提物都能起到誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌凋亡的作用[9]。β-谷甾醇能抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其抗癌機(jī)制可能與β-谷甾醇通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬作用有關(guān)[10]。羽扇豆酮為五環(huán)三萜類化合物[11]，也具有抗腫瘤作用。

葛根抗腫瘤作用主要作用于EGFR、ESR1、IL6、NCOA1、VEGFR等5個(gè)靶點(diǎn)，主要涉及前列腺癌、人巨細(xì)胞病毒感染、p53信號通路。研究表明，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的異常與前列腺癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Mitchell等發(fā)現(xiàn)AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞的生長，參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及前列腺癌細(xì)胞由雄激素敏感型向抵抗型轉(zhuǎn)變[12]。人巨細(xì)胞病毒是目前已知最大的β皰疹病毒，近年來的研究顯示在結(jié)直腸癌[13]、乳腺癌[14]和前列腺癌[15]及小細(xì)胞型肝癌等多種類型的腫瘤組織中都存在人巨細(xì)胞病毒感染和病毒基因表達(dá)，并與腫瘤的惡性程度相關(guān)[16]。p53轉(zhuǎn)錄激活多種線粒體凋亡信號基因，包括Bax、PUMA、NOXA、Apaf-1和Caspase-9，進(jìn)而促進(jìn)線粒體膜解體和隨后的Caspase激活[17]。細(xì)胞表面的跨膜蛋白與其同源配體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)Caspase-8/Caspase-10，最終激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等凋亡蛋白酶。這些結(jié)果與本研究一致，說明預(yù)測結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

通過系統(tǒng)藥理學(xué)分析，探討葛根抗腫瘤作用機(jī)制；采用分子對接進(jìn)一步驗(yàn)證其可靠性。結(jié)果表明，多種成分可作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，同一成分可與多個(gè)靶點(diǎn)作用，說明葛根抗腫瘤是通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用。通過對靶點(diǎn)蛋白基因分析可知：細(xì)胞周期控制和血管生成對其影響較大，且異黃酮類和β-谷甾醇類成分能起到干預(yù)作用，為新藥研發(fā)提供了新的途徑和策略。