朱 定，王存文，楊 芳*

(1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205)

黑水虻(HermetiaillucensL.)是一種原產(chǎn)于美洲、現(xiàn)廣泛分布于全球熱帶和溫帶地區(qū)的雙翅目昆蟲[1-2]。據(jù)報(bào)道，黑水虻幼蟲以各種各樣的有機(jī)材料為食，將其高效地轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)昆蟲蛋白，并已被用于小規(guī)模廢物處理，黑水虻幼蟲可食用的基質(zhì)包括稻草[3]、食物垃圾[4]、酒糟[5]、糞便污泥[6-7]、動(dòng)物內(nèi)臟以及廚余垃圾等[8]。大量研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后不僅便于生物體對(duì)其消化吸收，且水解產(chǎn)生的肽類還具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、降血壓及增強(qiáng)免疫力等[9]。目前，關(guān)于黑水虻幼蟲的研究主要集中在飼料[10]、生物柴油[11]以及抗菌肽[12]的開發(fā)等方面，對(duì)黑水虻幼蟲蛋白水解物氨基酸組成和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)的研究卻鮮有報(bào)道。

作者在制備黑水虻幼蟲蛋白的基礎(chǔ)上，選擇含量和得率相對(duì)較高的蛋白，通過堿性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解；并采用超濾方法將其蛋白水解物分為<3 kDa、3～10 kDa、>10 kDa等3種組分，通過氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定各組分的氨基酸組成，采用必需氨基酸比值(essential amino acid index，EAAI)、氨基酸比值(ratio of amino acid，RAA)以及氨基酸比值系數(shù)(ration coefficient of amino acid，RC)等營(yíng)養(yǎng)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)，為黑水虻幼蟲蛋白資源的綜合利用提供一定的參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

黑水虻幼蟲，湖北志民農(nóng)業(yè)科技有限公司。

堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；超濾管，Millipore公司；透析袋，上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、石油醚、乙醇、濃鹽酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Hitachi835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀，日本Hitachi公司；84-1A6型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)、XHF-DY型高速離心機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 黑水虻幼蟲蛋白的制備

采用石油醚法[13]對(duì)黑水虻幼蟲進(jìn)行脫脂。將黑水虻幼蟲洗凈，50 ℃烘干，粉碎；取10 g蟲粉，加入20 mL石油醚，于磁力攪拌器上攪拌1 h；倒出含有脂肪的溶劑，過濾回收，得石油醚脫脂蟲粉。

壓榨脫脂蟲粉由普羅歐生物科技(武漢)有限公司提供。

按照許彥騰[14]方法提取脫脂蟲粉中的粗蛋白。取10 g脫脂蟲粉，加入220 mL 24.4 g·L-1的NaOH溶液，在53.2 ℃、200 r·min-1搖床反應(yīng)2 h；將反應(yīng)液于8 000 r·min-1離心30 min；收集上清液，用1 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH值至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(4.8)，再次離心；收集沉淀，用去離子水復(fù)溶，并用0.1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性；將得到的鹽溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，于1 000 mL去離子水中4 ℃靜置透析48 h；將透析液于50 ℃、200 r·min-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥48 h，最終得到干燥的黑水虻幼蟲粗蛋白，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

采用醇洗法對(duì)黑水虻幼蟲粗蛋白進(jìn)一步精制。取黑水虻幼蟲粗蛋白，按固液比1∶10(g∶mL，下同)加入95%的乙醇，洗脫15 min，60 ℃烘干至恒重，得黑水虻幼蟲精制蛋白。采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量，按式(1)計(jì)算蛋白得率：

(1)

1.3 黑水虻幼蟲蛋白的水解和分級(jí)

取2 g黑水虻幼蟲蛋白溶解于100 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入40 mg堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L，55 ℃搖床反應(yīng)4 h；沸水浴10 min，滅酶；將蛋白水解液于8 000 r·min-1離心10 min；收集上清，依次通過10 kDa、3 kDa超濾管，分別得到<3 kDa、3～10 kDa、>10 kDa等3種不同分子量的超濾組分；冷凍干燥，-20 ℃保存，備用。分別按式(2)、(3)計(jì)算蛋白產(chǎn)率和蛋白回收率[15]：

(2)

(3)

1.4 氨基酸含量的測(cè)定

黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的氨基酸組成按Yang等[16]的方法測(cè)定。樣品經(jīng)6 mol·L-1鹽酸水解后使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析；含硫氨基酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量在甲酸預(yù)水解后測(cè)定；色氨酸的含量在堿性水解后測(cè)定。

1.5 黑水虻幼蟲蛋白水解物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

根據(jù)氨基酸組成情況，分別計(jì)算黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)、非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)、總氨基酸(total amino acid，TAA)含量和EAA/NEAA值；并根據(jù)氨基酸比值系數(shù)法[17]，將黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分中氨基酸組成與聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)中的人體必需氨基酸模式進(jìn)行對(duì)比，分別按式(4)、(5)、(6)計(jì)算EAAI[18]、RAA、RC[19]，評(píng)價(jià)黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

(4)

(5)

(6)

式中：n為氨基酸個(gè)數(shù)，n≤8；an為實(shí)驗(yàn)中必需氨基酸的含量，g·(100 g蛋白質(zhì))-1；bn為FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)應(yīng)必需氨基酸的含量，g·(100 g蛋白質(zhì))-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫脂方法對(duì)黑水虻幼蟲的蛋白含量和得率的影響

黑水虻幼蟲分別經(jīng)石油醚法和壓榨法脫脂后，再經(jīng)堿提酸沉法提取粗蛋白以及醇洗法精制蛋白，各步驟的蛋白含量與蛋白得率見表1。

表1黑水虻幼蟲的蛋白含量與蛋白得率/%

Tab.1 Protein content and protein yield of black soldier fly larvae/%

石油醚法蛋白含量蛋白得率壓榨法蛋白含量蛋白得率脫脂蟲粉53.01±0.44a———40.27±0.09a———粗蛋白粉63.16±0.27b46.02±0.43b69.53±0.18b42.31±0.67b精制蛋白粉80.75±0.18c92.18±0.75c82.91±0.18c89.43±0.32c

注：同一列中不同小寫字母(a、b、c)表示差異顯著(P<0.05)。

由表1可知，采用石油醚法和壓榨法兩種脫脂方法得到的脫脂蟲粉的蛋白含量分別為(53.01±0.44)%和(40.27±0.09)%；兩種脫脂蟲粉在經(jīng)過堿提酸沉法和醇洗法后，精制蛋白粉的蛋白含量均顯著提高，其中壓榨法脫脂得到的精制蛋白粉含量最高，達(dá)到了(82.91±0.18)%。因此，選擇壓榨法對(duì)黑水虻幼蟲蛋白進(jìn)行脫脂。

2.2 黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的蛋白產(chǎn)率與蛋白回收率

黑水虻幼蟲蛋白能被堿性蛋白酶有效水解成小分子多肽，從而有利于機(jī)體吸收，其相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)率和回收率影響到工業(yè)生產(chǎn)成本。黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的蛋白產(chǎn)率與蛋白回收率如圖1所示。

由圖1可知，黑水虻幼蟲蛋白水解物的蛋白產(chǎn)率和蛋白回收率分別為93.46%和85.47%；在超濾組分中，<3 kDa組分的蛋白產(chǎn)率和蛋白回收率最高，分別為63.41%和54.39%；>10 kDa組分的蛋白產(chǎn)率和蛋白回收率最低，分別為10.11%和7.95%。

圖1 黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的蛋白產(chǎn)率與蛋白回收率Fig.1 Protein yield and protein recovery of black soldier fly larvae protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions

2.3 黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的氨基酸組成

從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度來說，蛋白質(zhì)質(zhì)量的高低取決于它所含的氨基酸種類及其含量[20]。黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的氨基酸組成及含量見表2。

表2黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的氨基酸組成/[g·(100 g蛋白質(zhì))-1]

Tab.2 Amino acid composition of black soldier fly larvae protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions/[g·(100 g protein)-1]

由表2可知，黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的氨基酸含量有一定的差異，其中，天門冬氨酸和谷氨酸的含量最高，這與Huang等[21]的研究結(jié)論一致。蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低與EAA的種類、數(shù)量和比例有關(guān)，本研究中，<3 kDa組分的EAA/TAA值最高，為42.52%(FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)為40%)，說明黑水虻幼蟲蛋白水解物經(jīng)過超濾可以提高EAA/TAA值，從而提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.4 黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

2.4.1 EAAI法評(píng)價(jià)

根據(jù)FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)[19]，EAAI越高，蛋白質(zhì)氨基酸組成越合理，蛋白品質(zhì)越高。根據(jù)EAAI法實(shí)用評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：EAAI>0.95為優(yōu)質(zhì)蛋白，黑水虻幼蟲蛋白水解物和3種超濾組分的EAAI均高于1(表2)，均屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。其中，<3 kDa組分的EAAI和EAA/NEAA值均最高，分別為1.32和73.97%。表明，水解和超濾工藝可以進(jìn)一步提高黑水虻幼蟲蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.4.2 RAA和RC法評(píng)價(jià)

由EAA含量及比例計(jì)算RAA和RC，對(duì)黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表3。

表3黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分中各種必需氨基酸的RAA和RC比較

Fig.3Comparison of RAA and RC of EAA in different fractions of black soldier fly larvae protein hydrolysates and their

注：*為第一限制性氨基酸。

由表3可知，黑水虻幼蟲蛋白水解物中含硫氨基酸的RC最小，為第一限制性氨基酸；<3 kDa、3～10 kDa、>10 kDa等3種超濾組分的限制性氨基酸分別為蘇氨酸、含硫氨基酸、亮氨酸；RC超過1的有異亮氨酸、芳香族氨基酸。因此，可以選擇含硫氨基酸Met+Cys含量較高的食品作為補(bǔ)充，以提高黑水虻幼蟲蛋白食品的品質(zhì)。

3 結(jié)論

堿提酸沉法和醇洗法可逐級(jí)提高黑水虻幼蟲脫脂蟲粉的蛋白純度；黑水虻幼蟲蛋白水解物及其超濾組分的氨基酸種類齊全，且都屬于優(yōu)質(zhì)蛋白，其中<3 kDa組分的EAA/TAA值、EAA/NEAA值和EAAI均最高，分別為42.52%、73.97%和1.32，其第一限制性氨基酸為蘇氨酸。黑水虻幼蟲是一種容易獲得的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，其水解物的第一限制性氨基酸為含硫氨基酸Met+Cys，可與高含量的含硫氨基酸食品配合使用，更好發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)作用。