王潔琛，陳志周*，王 穎，劉 冰，馬倩云

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多糖，屬于納米級分子，純度高、結(jié)晶度高、機械性能良好、持水能力強、具有可調(diào)的表面化學(xué)性質(zhì)，這些特性使其在食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-2]。

許多細菌都能夠產(chǎn)生細菌纖維素。細菌纖維素的產(chǎn)生使細菌與富氧表面接觸，保護細胞免受紫外線等不利因素的影響，保持水分，增強定殖能力，還與細菌的趨化性有關(guān)[3-4]。不同來源的菌株產(chǎn)生細菌纖維素的能力有所不同，木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）是目前已知的細菌纖維素合成能力最強的菌種[5]。除木醋桿菌外，紅茶菌也具有產(chǎn)生細菌纖維素的能力，產(chǎn)量相對較高[6]。紅茶菌是醋酸菌和酵母菌的共生體，其微生物組成與地理條件、氣候條件和培養(yǎng)基條件有關(guān)[7]，但是醋酸菌的種類比較穩(wěn)定，主要包括Gluconacetobacter、Komagataeibacter、Acetobacter，負責(zé)產(chǎn)生細菌纖維素；酵母菌的種類相對豐富，主要包括Brettanomyces、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyces[8]。在自然形成的群落中，酵母菌與許多微生物形成了共生關(guān)系，如酵母菌通過谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、組氨酸等氨基酸以及某些維生素和輔因子提高乳酸菌的生長速率，促進乳酸菌增殖，而不必進行直接物理接觸[9-12]。

有研究表明，酵母菌的發(fā)酵液能夠促進細菌纖維素的合成，推測除了乙醇外還有其他代謝產(chǎn)物在起作用[13]。酵母菌不僅會影響細菌纖維素的合成，而且酵母細胞的疏水性還有助于加強細菌纖維的結(jié)構(gòu)[14]。為了明確紅茶菌中的醋酸菌和酵母菌在產(chǎn)細菌纖維素時的作用關(guān)系，對紅茶菌中的醋酸菌和酵母菌進行分離和鑒定，通過純培養(yǎng)和共培養(yǎng)研究酵母菌對醋酸菌產(chǎn)細菌纖維素的影響，為初步了解紅茶菌中微生物間的相互作用以及提高細菌纖維素的產(chǎn)量提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）1.1812：中國普通微生物菌種保藏管理中心。紅茶菌：市售。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）：天津市天大化工實驗廠；蛋白胨，酵母浸粉（均為生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；納他霉素：阿拉丁試劑有限公司；纖維素酶（15 000 U/g）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、2×Taq聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混試劑：天根生化科技有限公司；引物：通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

HS培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.5%，檸檬酸0.115%，十二水合磷酸氫二鈉0.68%，用醋酸將pH調(diào)至6.0。

HS平板培養(yǎng)基：在HS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入0.1%納他霉素和1.8%瓊脂。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽汁提取物2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.1%，瓊脂1.5%。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH。

糖茶水：大紅袍1%，葡萄糖15%，自然pH。

1.2 儀器與設(shè)備

F-1安全智能型反壓高溫蒸煮鍋：北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺：北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)有限公司；EPS-300型電泳儀：上海天能科技有限公司；9700型PCR儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化、接種和培養(yǎng)

醋酸菌的活化、接種和培養(yǎng)：將菌種轉(zhuǎn)接至HS平板培養(yǎng)基上以獲得單菌落，然后在50 mL HS培養(yǎng)基中接種2環(huán)菌種，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液。采用稀釋涂布平板法對種子液中的醋酸菌進行計數(shù)，按照100 mL HS培養(yǎng)基約1×104CFU的比例進行接種，接種完成后30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

酵母菌的活化、接種和培養(yǎng)：將菌種轉(zhuǎn)接至麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上以獲得單菌落，然后在50 mL YPD培養(yǎng)基中接種4環(huán)菌種，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液。采用稀釋涂布平板法對種子液中的酵母菌進行計數(shù)，按照醋酸菌與酵母菌的比例為1∶1、1∶10、1∶100和1∶1 000在100 mL HS培養(yǎng)基進行接種，接種完成后30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

紅茶菌的活化、接種和培養(yǎng)：在300 mL糖茶水加入40 g紅茶菌膜，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d，使用液面新產(chǎn)生的菌膜進行接種，100 mL HS培養(yǎng)基中加入1 g菌膜，接種完成后30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

1.3.2 細菌纖維素產(chǎn)量的測定

培養(yǎng)結(jié)束后，將細菌纖維素膜剪碎，稱取1 g碎膜加入9 mL無菌生理鹽水中，同時加入200 μL 3 000 U/mL的纖維素酶進行酶解，酶解完全后在HS平板培養(yǎng)基中進行稀釋涂布以獲得醋酸菌的數(shù)量。剩余的碎膜放入稱量瓶中，105 ℃烘干至質(zhì)量恒定，根據(jù)含水率求得細菌纖維素的產(chǎn)量。

1.3.3 紅茶菌中醋酸菌和酵母菌的分離鑒定

在90 mL無菌生理鹽水中加入10 mL紅茶菌發(fā)酵液、1 g菌膜和300 μL無菌纖維素酶液，待菌膜完全酶解后進行稀釋，分別涂布在HS平板培養(yǎng)基和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，待菌落長出后，挑取形態(tài)不同的單菌落反復(fù)純化。利用基因組脫氧核糖核酸提取試劑盒對菌株的基因組DNA進行提取，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3'）對醋酸菌的16S rDNA序列進行擴增，NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）對酵母菌的26S rDNA序列進行擴增。PCR反應(yīng)體系為Mix酶（TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、buffer）26 μL，ddH2O 21 μL，模板1 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL。PCR擴增條件為96 ℃預(yù)變性3 min，96 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司進行測序，將測序結(jié)果在GenBank中進行基本局部比對搜索工具（basiclocalalignment search tool，BLAST）比對，構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，NJ）法系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 木醋桿菌和紅茶菌細菌纖維素產(chǎn)量的比較

培養(yǎng)7 d后，木醋桿菌和紅茶菌的細菌纖維素產(chǎn)量及醋酸菌的最終數(shù)量如表1所示。

表1 培養(yǎng)7 d后木醋桿菌和紅茶菌的細菌纖維素產(chǎn)量及醋酸菌的最終菌落數(shù)Table 1 Bacterial cellulose yield and final colony count of Gluconacetobacter xylinum and kombucha after culture for 7 d

由表1可知，紅茶菌的細菌纖維素產(chǎn)量大約是木醋桿菌的5.1倍，而且在初始接種量相同的情況下，紅茶菌中醋酸菌的最終菌落數(shù)大約是木醋桿菌的100倍，說明紅茶菌中醋酸菌的增殖速度快于木醋桿菌，從而產(chǎn)生更多的細菌纖維素。紅茶菌中的酵母菌可能對細菌纖維素的產(chǎn)生具有積極作用。

2.2 紅茶菌中醋酸菌分離鑒定

為了確定紅茶菌中醋酸菌的種屬，通過涂布平板法對其進行分離。從紅茶菌中分離出1株醋酸菌，編號A1，其菌落形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株A1菌落較小，淡黃色，邊緣不整齊，不透明。利用PCR法擴增得到了A1的16S rDNA序列，測序后，通過BLAST比對，并利用MEGA構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

圖1 菌株A1的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strain A1

圖2 菌株A1基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A1 based on 16S rDNA sequences

由圖2可知，菌株A1與Komagataeibacter intermedius聚為一支，相似度為99.93%，因此初步鑒定菌株A1為居間駒形桿菌（Komagataeibacter intermedius）。K.intermedius不僅可以耐受高濃度的乙醇和乙酸，而且可以有效的生產(chǎn)細菌纖維素和葡萄糖酸，已被廣泛應(yīng)用于食品和制藥工業(yè)[15]。

為了確定菌株A1是否能夠產(chǎn)生細菌纖維素及產(chǎn)細菌纖維素的能力，將其接種到HS培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)7 d后測定細菌纖維素產(chǎn)量，以木醋桿菌作為對照，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，雖然菌株A1的最終菌落數(shù)是木醋桿菌的100倍，但是兩者的細菌纖維素產(chǎn)量幾乎相同，說明菌株A1產(chǎn)生細菌纖維素的能力不如木醋桿菌，但是紅茶菌產(chǎn)生的細菌纖維素遠遠多于菌株A1，這表明紅茶菌中的酵母菌能夠極大的促進菌株A1產(chǎn)生細菌纖維素。

表2 菌株A1和木醋桿菌的細菌纖維素產(chǎn)量及最終菌落數(shù)Table 2 Bacterial cellulose yield and final colony count of strain A1 and Gluconacetobacter xylinum

2.3 紅茶菌中酵母菌的分離鑒定

為了探究酵母菌對菌株A1的作用，通過涂布平板法對紅茶菌中的酵母菌進行分離。從紅茶菌中分離出3株酵母菌，編號為Y1、Y2和Y3，其中Y1數(shù)量最多，為優(yōu)勢酵母，它們的菌落形態(tài)見圖3。

圖3 菌株Y1（a）、Y2（b）、Y3（c、d）的菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of strain Y1 (a)、Y2 (b)、Y3 (c,d)

由圖3可知，Y1的菌落為白色，圓形，邊緣整齊，側(cè)面為山丘狀突起，表面光滑濕潤，不透明；Y2的菌落為白色，圓形扁平狀，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明；Y3的菌落為白色，圓形，菌落邊緣及背面為栗色，邊緣整齊，菌落中央有圓形突起，表面光滑濕潤，不透明。利用PCR法擴增得到了Y1、Y2和Y3的26S rDNA序列，測序后，通過BLAST比對，并利用MEGA構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，菌株Y1與Brettanomyces bruxellensis聚為一支，相似度為99.49%，因此初步鑒定菌株Y1為布魯塞爾酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）；菌株Y2與Zygosaccharomyces bisporus聚為一支，相似度為99.19%，因此初步鑒定菌株Y2為二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）；菌株Y3與Metschnikowiafructicola聚為一支，相似度為99.43%，因此初步鑒定菌株Y3為核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）。Brettanomyces和Zygosaccharomyces通常被認為是腐敗酵母，對低pH值、高乙醇濃度和高滲透壓具有耐受性[16-17]，這使得其非常適合紅茶菌發(fā)酵液的環(huán)境。Metschnikowia常被用作拮抗酵母，用于控制水果和蔬菜上的病原體[18]。通過激活宿主防御機制，提高苯丙烷代謝途徑中一系列酶的表達水平達到控制病原體的效果[19]。

圖4 菌株Y1、Y2和Y3基于26S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain Y1,Y2 and Y3 based on 26S rDNA sequences

2.4 酵母菌對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

為了探究菌株Y1對菌株A1產(chǎn)細菌纖維素的影響，按照不同的比例將兩者接種在HS培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)7 d后收獲細菌纖維素，各組細菌纖維素產(chǎn)量結(jié)果見圖5，不同酵母菌株與A1共培養(yǎng)的細菌纖維素產(chǎn)量結(jié)果見圖6。

圖5 菌株A1與Y1共培養(yǎng)的細菌纖維素產(chǎn)量Fig.5 Bacterial cellulose yield by strain A1 co-culture with strain Y1

由圖5可知，細菌纖維素產(chǎn)量隨著菌株Y1比例的增加呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，但均高于對照組，表明菌株Y1能夠促進菌株A1產(chǎn)生細菌纖維素。當菌株A1與Y1的比例為1∶100時，產(chǎn)生的細菌纖維素最多，為4.70 g/L，約是菌株A1純培養(yǎng)的3.2倍，但是少于紅茶菌產(chǎn)生的細菌纖維素，可能菌株Y2和Y3對A1也具有促進作用。由圖6可知，菌株Y2對菌株A1具有較強的促進作用，但不及菌株Y1，而菌株Y3對菌株A1沒有促進作用。有研究表明，在發(fā)酵過程中酵母菌產(chǎn)生的低濃度乙醇能夠促進醋酸菌產(chǎn)生細菌纖維素，除此之外，3-甲基丁醇、乙酸、乳酸、糠醛和某些氨基酸也在這個過程中起作用[20]。

圖6 不同酵母菌株與A1共培養(yǎng)的細菌纖維素產(chǎn)量Fig.6 Bacterial cellulose yield by strain A1 co-culture with different yeast strains

3 結(jié)論

通過培養(yǎng)的方法從紅茶菌中分離得到1株醋酸菌A1和3株酵母菌（Y1、Y2及Y3）。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定分別為居間駒形桿菌（Komagataeibacter intermedius）；布魯塞爾酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）、二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）和核果梅奇酵母（Metschnikowia fruc ticola），其中B.bruxellensis為優(yōu)勢酵母。將K.intermedius與B.bruxellensis以1∶100的比例共培養(yǎng)時產(chǎn)生的細菌纖維素最多，為4.70 g/L，是K.intermedius純培養(yǎng)的3.2倍；K.intermedius與Z.bisporus以1∶100的比例共培養(yǎng)時產(chǎn)生的細菌纖維素為3.59 g/L，是K.intermedius純培養(yǎng)的2.5倍；K.intermedius與M.fructicola以1∶100的比例共培養(yǎng)時產(chǎn)生的細菌纖維素與K.intermedius純培養(yǎng)幾乎相同。結(jié)果表明，紅茶菌中B.bruxellensis和Z.bisporus能夠促進K.intermedius產(chǎn)細菌纖維素，而M.fructicola對K.intermedius沒有明顯的促進作用。