吳傳玲 劉安琪 左中夫 劉文強(qiáng) 劉學(xué)政

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最嚴(yán)重、最主要的并發(fā)癥之一，DR的發(fā)病率隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)而增加[1]，是成年人視力減退的重要原因之一[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，DR視網(wǎng)膜中p38絲裂原激活蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase,p38-MAPK)通路被激活，Müller細(xì)胞中的膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(L-glutamate/L-asparate transporter,GLAST)活性下降，谷氨酸堆積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)不可逆性死亡[3]。Raf-1激酶抑制蛋白(raf-1 kinase inhibitory protein,RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族成員，是MAPK通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑途徑[4]。研究表明，RKIP在神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元凋亡和認(rèn)知缺陷中起重要作用，視網(wǎng)膜損傷后RKIP的表達(dá)明顯降低，RKIP過表達(dá)可抑制RGC凋亡[5]。因此，本研究通過注射含有RKIP基因片段的慢病毒載體擬探討RKIP通過p38-MAPK通路對(duì)糖尿病(DM)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步為DR的發(fā)生發(fā)展和發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)SD大鼠48只，體質(zhì)量220～250 g(錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，每天給予清潔級(jí)飼料，室溫環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食水，通風(fēng)良好，12 h光照晝夜循環(huán)。

1.1.2 試劑與儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國Sigma公司)；LV-RKIP(加拿大ABM生物科技有限公司)；GLAST、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、RKIP和p38-MAPK一抗及免疫熒光二抗(英國Abcom公司)；Western blot二抗(北京索萊寶科技有限公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；凝膠成像系統(tǒng)、垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組STZ粉末溶于0.01 μmol·L-1、pH 4.5的檸檬酸鈉溶液中，使用前配制，避光保存。SD大鼠禁飲食12 h后，采用單次腹腔注射STZ(50 mg·kg-1)建立DM模型,72 h后檢測(cè)尾靜脈血糖，血糖>16.7 mmol·L-1的大鼠為DM模型建立成功。將SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、糖尿病組、空白組、RKIP組，每組12只，其中糖尿病組、空白組和RKIP組大鼠為DM模型大鼠。

1.2.2 RKIP慢病毒載體玻璃體內(nèi)注射模型誘導(dǎo)成功后參考文獻(xiàn)[5]RKIP組于DM模型建成后第2周，腹腔注射水合氯醛全身麻醉，鹽酸丙美卡因眼球表面麻醉，隨機(jī)選取大鼠一側(cè)眼球，在解剖顯微鏡下用微量進(jìn)樣器抽取5 μL RKIP慢病毒載體沿內(nèi)眥角膜緣后1.0 mm處注入玻璃體內(nèi)，而空白組注射等量空白病毒。對(duì)照組和糖尿病組按照上述方法在玻璃體內(nèi)注射等量生理鹽水。10周后取各組視網(wǎng)膜組織進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中RKIP、p38-MAPK蛋白表達(dá)每組隨機(jī)取6只大鼠的新鮮視網(wǎng)膜組織加入蛋白裂解液，快速剪碎后使用超聲波裂解儀裂解組織，4 ℃ ，12 000 r·min-1離心25 min,取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入10 μL 樣品電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)膜后10 g·L-1BSA室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗大鼠RKIP，13000；兔抗大鼠p38-MAPK，13000；兔抗大鼠GAPDH，13000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌4次，每次5 min；加入二抗(生物素標(biāo)記的山羊抗兔，13000)室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，每次5 min；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行校正，計(jì)算目的蛋白R(shí)KIP及p38-MAPK的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫熒光化學(xué)檢測(cè)視網(wǎng)膜中GLAST、GS表達(dá)每組隨機(jī)取6只大鼠，100 g·L-1水合氯醛全身麻醉后，40 g·L-1多聚甲醛心臟灌流，快速取雙側(cè)眼球，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，脫蠟至水，抗原修復(fù)后于PBS中洗滌3次，每次3 min；加入體積分?jǐn)?shù)3%山羊血清和體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton-100室溫孵育30 min，滴加一抗(兔抗大鼠GLAST，1100；小鼠抗大鼠GS，1100)，4 ℃過夜。PBS洗滌3次，每次3 min，滴加二抗(A594標(biāo)記驢抗兔，1500；A488標(biāo)記羊抗小鼠，1500)，室溫避光孵育2 h，PBS洗滌3次，每次3 min，抗熒光封片劑封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 HE染色檢測(cè)RGC密度四組視網(wǎng)膜組織切片脫蠟至水，PBS洗滌3次，每次3 min，蘇木素浸染2 min，分化液10 s，置于堿水中返藍(lán)2 min，伊紅浸染2 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜RKIP、p38-MAPK蛋白表達(dá)四組RKIP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2809.42，P<0.01)。與對(duì)照組相比，糖尿病組RKIP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；與糖尿病組相比，空白組RKIP相對(duì)表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，RKIP組RKIP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。四組p38-MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3388.34，P<0.01)。與對(duì)照組相比，糖尿病組p38-MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；與糖尿病組相比，空白組p38-MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，RKIP組p38-MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。見表1、圖1。

圖1 Western blot 檢測(cè)各組RKIP、p38-MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量

組別RKIP/%p38-MAPK/%對(duì)照組26.67±0.693.34±0.27糖尿病組11.50±0.3922.34±0.66空白組10.91±0.2023.81±0.30RKIP組63.97±2.1312.96±0.31F值2809.423388.34P值0.0000.000

2.2 免疫熒光化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜GLAST免疫熒光化學(xué)檢測(cè)結(jié)果各組大鼠視網(wǎng)膜各層均有GLAST表達(dá)。與對(duì)照組相比，糖尿病組視網(wǎng)膜GLAST表達(dá)在內(nèi)核層及外核層明顯減少(P<0.01)；與糖尿病組相比，空白組視網(wǎng)膜GLAST表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，而RKIP組GLAST表達(dá)在內(nèi)核層及外核層明顯增加(P<0.01)。各組間光密度(A)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.37，P<0.01)。見表2與圖2。

組別GLAST/%GS/%對(duì)照組30.10±0.5932.43±1.25糖尿病組22.09±0.929.81±0.30空白組22.06±1.059.94±1.38RKIP組28.15±1.0729.85±0.80F值82.37556.66P值0.0000.000

2.2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜GS免疫熒光化學(xué)檢測(cè)結(jié)果免疫熒光化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，GS在各組大鼠視網(wǎng)膜全層均有表達(dá)。各組間A值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=556.66，P<0.01)。與對(duì)照組相比，糖尿病組和空白組視網(wǎng)膜GS表達(dá)均明顯減少(均為P<0.01)，而RKIP組視網(wǎng)膜GS表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；與糖尿病組相比，空白組視網(wǎng)膜GS表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，而RKIP組視網(wǎng)膜GS表達(dá)明顯增加(P<0.01)。見表2與圖3。

2.3 HE染色結(jié)果對(duì)照組、糖尿病組、空白組以及RKIP組大鼠視網(wǎng)膜RGC密度分別為(423.26±3.74)個(gè)·mm-2、(216.02±10.47)個(gè)·mm-2、(215.40±13.51)個(gè)·mm-2、(412.49±11.67)個(gè)·mm-2。各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=479.97，P<0.01)。與對(duì)照組相比，糖尿病組和空白組RGC密度均明顯降低(均為P<0.01)，而RKIP組RGC密度無明顯變化(P>0.05)。見圖4。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GLAST表達(dá)(紅色，×400) A：對(duì)照組；B：糖尿病組；C：空白組；D：RKIP組

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS表達(dá)(綠色，×400) A：對(duì)照組；B：糖尿病組；C：空白組；D：RKIP組

圖4 HE染色觀察各組視網(wǎng)膜RGC密度(箭頭，×400) A：對(duì)照組；B：糖尿病組；C：空白組；D：RKIP組

3 討論

DR是糖尿病最嚴(yán)重、最主要的并發(fā)癥之一，會(huì)引起成年人視力嚴(yán)重減退。Müller細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中主要的膠質(zhì)細(xì)胞類型，是維持視網(wǎng)膜RGC功能的關(guān)鍵細(xì)胞[6]。RKIP是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族的成員，最初從牛腦中純化，是一種保守的小胞漿蛋白，其在神經(jīng)發(fā)育、心臟功能和精子發(fā)生等過程中均具有重要的生理功能[7-8]。此外，RKIP作為Raf/MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)因子與MAPK通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑途徑[4]，其在神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的遺傳缺陷中也起重要作用[5]。

MAPK級(jí)聯(lián)可影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程[9]。p38-MAPK是由各種細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞因子激活的主要MAPK途徑之一，如促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和活性氧。p38-MAPK在糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥中起重要作用，降低糖尿病中p38-MAPK的活化能夠抑制糖尿病誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的死亡與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的退化，這為抑制糖尿病視網(wǎng)膜早期病變和糖尿病其他并發(fā)癥的發(fā)展提供了一種新的治療方法[10]。有研究表明,RKIP基因敲除可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi) p38-MAPK激活[11]，RKIP的缺失會(huì)增強(qiáng)p38-MAPK的活化[12]，而RKIP的過表達(dá)可以抑制P38-MAPK的磷酸化[13]。

GLAST是視網(wǎng)膜中主要的神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，僅在Müller細(xì)胞中表達(dá)。 GS是參與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸代謝的主要酶。細(xì)胞外谷氨酸經(jīng)過GLAST介導(dǎo)攝取進(jìn)入Müller細(xì)胞，通過GS迅速轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，隨后運(yùn)回神經(jīng)元進(jìn)行谷氨酸再合成[14]。Müller細(xì)胞可將過多的谷氨酸轉(zhuǎn)化為無毒的谷氨酰胺，這對(duì)維持視網(wǎng)膜正常功能尤為重要[15]。RGC中含有豐富的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)谷氨酸受體，使它們特別容易受到谷氨酸興奮毒性的影響。谷氨酸是光感受器-雙極-神經(jīng)節(jié)細(xì)胞回路的主要視網(wǎng)膜興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它通常在神經(jīng)元內(nèi)高水平表達(dá)，但在細(xì)胞外保持低濃度，使興奮性毒性最小化。在DR中，已經(jīng)證實(shí)了谷氨酸穩(wěn)態(tài)的破壞[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，糖尿病組和空白組GLAST和GS表達(dá)在內(nèi)核層和外核層中均明顯下降，而給予RKIP慢病毒載體，使其在視網(wǎng)膜中表達(dá)并抑制p38-MAPK后，RKIP組視網(wǎng)膜中內(nèi)核層和外核層GLAST和GS表達(dá)均升高，提示RKIP在一定程度上保護(hù)了Müller細(xì)胞。并且我們觀察到，在給予RKIP慢病毒載體后，與糖尿病組和空白組相比，RKIP組視網(wǎng)膜中RGC密度明顯升高，提示RKIP通過保護(hù)Müller細(xì)胞，進(jìn)而阻止了RGC受到谷氨酸興奮毒性的影響。

綜上，在DR早期給予RKIP后可抑制視網(wǎng)膜中p38-MAPK通路，上調(diào)GLAST和GS表達(dá)活性，在一定程度上改善DR病理狀態(tài)下Müller細(xì)胞的功能，從而減少谷氨酸興奮毒性導(dǎo)致的RGC凋亡。但是RKIP通過抑制p38-MAPK通路對(duì)Müller細(xì)胞和RGC的保護(hù)作用機(jī)制是多信號(hào)途徑的。因此，RKIP在DR狀態(tài)下對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷的保護(hù)作用方式還有待進(jìn)一步研究。

致謝：非常感謝我的導(dǎo)師劉學(xué)政教授的支持和幫助，感謝左中夫副教授和劉文強(qiáng)老師的指導(dǎo)，感謝師弟師妹們的鼓勵(lì)。