曹瑾 呂旭東

角膜病是我國(guó)主要的致盲眼病之一。正常情況下，角膜處于無(wú)血管狀態(tài)，周?chē)芙K止于角膜緣，形成血管網(wǎng)。角膜的無(wú)血管狀態(tài)是維持角膜透明和保證良好視力的關(guān)鍵。在病理狀態(tài)下，新生毛細(xì)血管由角膜緣侵入角膜內(nèi)，導(dǎo)致角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)的眼科就診患者中4.14%病因是CNV形成[1]。多種眼科疾病引起的CNV形成并最終導(dǎo)致患眼失明已成為目前眼科界面臨的重要難題[2]。因此，對(duì)CNV發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究，一直是眼科領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生[3]。其中，VEGF-A在新生血管形成中起著關(guān)鍵作用。研究顯示，VEGF-A結(jié)合VEGFR2后可激活多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[包括FAK/Paxillin(PXN)通路]調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[4]。PXN是一種結(jié)構(gòu)和信號(hào)蛋白，主要定位于黏著斑。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然PXN分子本身可能不具有酶活性，但其分子中含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和多種結(jié)構(gòu)域，能夠與多種信號(hào)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，將來(lái)自上游的信號(hào)整合，并高效地向下游傳遞，起著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)“中轉(zhuǎn)站”的作用[5]，其中PXN的第31位(PXN-pY31)和第118 位(PXN-pY118)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)與細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移密切相關(guān)[6]。已有大量的研究證實(shí)，PXN在促進(jìn)腫瘤生成及轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[7]。然而在眼科領(lǐng)域，還未見(jiàn)有關(guān)PXN在CNV發(fā)生中的作用的報(bào)道。本研究擬探討PXN-pY31、PXN-pY118在CNV形成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，為抗CNV的藥物設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取6～8周齡雄性C57BL6小鼠36只，體質(zhì)量25～30 g。由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均為清潔級(jí)，在SPF級(jí)環(huán)境中使用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)鼠飼料飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求，眼科檢查均未發(fā)現(xiàn)眼部疾患。所有小鼠均選取右眼制備堿燒傷模型，作為實(shí)驗(yàn)組；左眼未作處理，作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑及儀器GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司)；PXN(美國(guó)Bioworld公司，BS3585)；PXN-pY31(美國(guó)Bioworld公司，BS4721)；PXN-pY118(美國(guó)Bioworld公司，BS4154)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1054)。顯微手術(shù)器械(蘇州六六股份有限公司)；眼科裂隙燈(日本拓普康SL-3G)。

1.3 小鼠角膜堿燒傷模型的建立參照文獻(xiàn)[8]建立小鼠右眼角膜堿燒傷模型。使用0.15 mL戊巴比妥鈉(10 μL·g-1)腹腔注射誘導(dǎo)小鼠全身麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼液滴右眼2次后，棉簽吸除結(jié)膜囊內(nèi)液體，眼局部碘伏消毒，將直徑4 mm的濾紙浸泡在1 mol·L-1NaOH溶液中，浸透后置于角膜中央2 min，取下濾紙，立即用氯霉素沖洗角膜及結(jié)膜囊，生理鹽水繼續(xù)沖洗1 min，常規(guī)喂養(yǎng)。分別于堿燒傷后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d裂隙燈下觀察CNV生長(zhǎng)情況，同時(shí)將有角膜潰瘍、前房積膿等并發(fā)癥發(fā)生的小鼠排除于實(shí)驗(yàn)之外，并補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.4 CNV的定量測(cè)定指標(biāo)選擇測(cè)定指標(biāo)：(1)最大新生血管長(zhǎng)度:以彎曲度小并與角膜緣切線垂直的新生血管長(zhǎng)度為準(zhǔn)，取最大血管長(zhǎng)度；(2)新生血管鐘點(diǎn)數(shù)：新生血管網(wǎng)的跨圓周鐘點(diǎn)數(shù)；(3)計(jì)算新生血管面積：新生血管面積=0.5×最大新生血管長(zhǎng)度×新生血管鐘點(diǎn)數(shù)×0.4。

1.5 組織病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)分別在堿燒傷后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d各隨機(jī)抽取2只小鼠過(guò)量麻醉處死，取實(shí)驗(yàn)眼及對(duì)照眼全角膜，常規(guī)固定脫水，石蠟包埋切片，采用二步法進(jìn)行PXN-pY31和PXN-pY118的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。免疫組織化學(xué)染色標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。

1.6 Western blot檢測(cè)分別在堿燒傷后1 d、3 d、5 d、7 d各隨機(jī)抽取6只小鼠過(guò)量麻醉處死，將右眼(即實(shí)驗(yàn)組)全角膜取出，然后加150 μL裂解液裂解，測(cè)蛋白濃度后，取75 μg總蛋白上樣，根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量配制100 g·L-1的PAGE膠電泳，用含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h，一抗(PXN、PXN-pY31、PXN-pY118抗體均為1500稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST充分洗滌。使用HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(130 000)作用2 h，TBST充分洗滌，待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，使用BandScan分析膠片灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)間相比采用單因素方差分析(one-way ANOVA),進(jìn)一步兩兩相比采用Student’st-檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 角膜裂隙燈下觀察對(duì)照組角膜透明、無(wú)血管。實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后1 d可見(jiàn)角膜水腫，角膜緣血管增粗并充血明顯；堿燒傷后3 d可見(jiàn)角鞏膜緣處有新生血管芽呈刷狀長(zhǎng)入透明角膜區(qū)；堿燒傷后5 d可見(jiàn)角鞏膜緣處新生血管較前粗大、密集并明顯變長(zhǎng)，新生血管面積增加、鐘點(diǎn)數(shù)增加；堿燒傷后7 d可見(jiàn)角膜緣血管管徑無(wú)明顯變化，但生長(zhǎng)緩慢，小部分新生血管出現(xiàn)萎縮；堿燒傷后14 d可見(jiàn)新生血管變長(zhǎng)，較初期變得稀疏，新生血管面積減少，鐘點(diǎn)數(shù)也有所減少，整個(gè)過(guò)程呈曲線樣改變(見(jiàn)圖1和圖2)。

2.2 PXN-pY31和PXN-pY118表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后1 d，角膜上皮層即可見(jiàn)PXN-pY31和PXN-pY118的陽(yáng)性表達(dá)；堿燒傷后3 d，角膜上皮層可見(jiàn)PXN-pY31和PXN-pY118的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，基質(zhì)層可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，伴隨炎癥細(xì)胞的出現(xiàn)；堿燒傷后5 d，實(shí)驗(yàn)組角膜上皮層增厚，PXN-pY31和PXN-pY118的表達(dá)明顯增強(qiáng)，基質(zhì)層出現(xiàn)PXN-pY31和PXN-pY118的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，伴隨有不成熟新生血管腔出現(xiàn)；堿燒傷后7 d、10 d、14 d，角膜基質(zhì)層的PXN-pY31和PXN-pY118表達(dá)均呈下降趨勢(shì)(圖3)。PXN-pY31和PXN-pY118在堿燒傷后的表達(dá)變化與CNV長(zhǎng)度、鐘點(diǎn)數(shù)和面積的變化趨勢(shì)一致，表明PXN-pY31和PXN-pY118在CNV的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著調(diào)控作用。

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。角膜堿燒傷后3 d，實(shí)驗(yàn)組角膜中PXN-pY31和PXN-pY118表達(dá)顯著升高，與堿燒傷后1 d相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；堿燒傷后5 d，實(shí)驗(yàn)組角膜中PXN-pY31和PXN-pY118表達(dá)達(dá)到高峰，與堿燒傷后1 d相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；堿燒傷后7 d，角膜中PXN-pY31和PXN-pY118表達(dá)開(kāi)始下降，但與堿燒傷后1 d相比，差異仍均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。PXN在堿燒傷后隨時(shí)間推移表達(dá)無(wú)明顯變化(均為P>0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)新生血管的長(zhǎng)度、鐘點(diǎn)數(shù)和面積變化曲線圖

圖2 實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜裂隙燈顯微鏡下觀察 A:堿燒傷后1 d；B:堿燒傷后3 d；C:堿燒傷后5 d；D:堿燒傷后7 d

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)兩組堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜PXN-pY31 和PXN-pY118的表達(dá)(棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)；×400) A：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后3 d PXN-pY31 的表達(dá)；B：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后5 d PXN-pY31 的表達(dá)； C:實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后3 d PXN-pY118 的表達(dá)；D:實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后5 d PXN-pY118 的表達(dá)；E：對(duì)照組PXN-pY31的表達(dá)； F：對(duì)照組PXN-pY118的表達(dá)

圖4 Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組角膜組織中PXN、PXN-pY31及PXN-pY118蛋白表達(dá) 與堿燒傷后1 d相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直致力于研究CNV的發(fā)病機(jī)制以及能阻止其形成的抑制劑，當(dāng)前對(duì)于CNV形成的機(jī)制較為認(rèn)可的為血管因子平衡機(jī)制[9]，即一旦血管因子平衡被打破，即可出現(xiàn)新生血管。VEGF是目前公認(rèn)的在眾多血管調(diào)控因子中功能最強(qiáng)的促血管形成因子[10]，也是內(nèi)源性角膜血管生長(zhǎng)因子之一[11-12]，是CNV形成過(guò)程中的關(guān)鍵血管因子。另外，眾所周知，血管生成是腫瘤侵襲生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移所必需的，VEGF已被證實(shí)可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤中血管的生成從而有利于腫瘤的生成與進(jìn)展[13]。近年來(lái)研究表明，PXN在腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲過(guò)程中起著重要作用[14]。因此我們推測(cè)，PXN的磷酸化與血管的形成密切相關(guān)，這可能與其和VEGF的相互作用有關(guān)[15]?，F(xiàn)有研究表明，許多由VEGF引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞生理或病理的改變大多是由VEGFR-2 所介導(dǎo)，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活一系列的下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂、增殖和遷移，改變細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)以降解基質(zhì)，達(dá)到促進(jìn)腫瘤新生血管形成的結(jié)果，這其中就包括FAK-PXN通路[16]。有研究顯示，利多卡因可以通過(guò)抑制VEGFR-2、PLC-PKC-MAK和FAK-PXN的磷酸化從而顯著抑制腫瘤血管的生成[17]。PXN的正常表達(dá)在細(xì)胞黏附和遷移過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用，其通過(guò)多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)連接網(wǎng)絡(luò)相互作用，并在磷酸化調(diào)節(jié)的相互作用下，調(diào)控細(xì)胞的增殖、黏附、遷移等功能，并參與細(xì)胞骨架的重組[18-20]。體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞在遷移時(shí)能刺激FAK與PXN磷酸化水平提高[21]，推測(cè)PXN在維持角膜正常生理狀態(tài)中同樣發(fā)揮著一定的作用。

另外，在病理狀態(tài)下，如角膜的創(chuàng)傷會(huì)增加細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化，以及FAK和PXN的酪氨酸磷酸化，證明細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-FAK-PXN信號(hào)通路在活體角膜上皮損傷愈合修復(fù)中可能起重要作用[22-23]。但在愈合過(guò)程中持續(xù)的角膜損傷或炎癥則可引起CNV、角膜云翳等，導(dǎo)致視力不可逆性下降，甚至視力喪失[24]。在眼科領(lǐng)域，未見(jiàn)有關(guān)PXN在CNV形成中作用的報(bào)道。因此，研究PXN在CNV形成中的機(jī)制，可以更為深入地了解CNV發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

為研究PXN在CNV形成中的作用，我們成功建立了小鼠CNV模型，觀察CNV形成過(guò)程中新生血管的形態(tài)和變化規(guī)律以及下游蛋白PXN的磷酸化活性表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PXN-pY31和PXN-pY118的表達(dá)增加與CNV的增加呈正相關(guān)改變：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，堿燒傷后1 d，角膜組織中PXN-pY31和PXN-pY118的表達(dá)即明顯增強(qiáng)；堿燒傷后5 d達(dá)到高峰，之后逐漸下降，這與觀察到的小鼠CNV的生長(zhǎng)情況一致。在堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)，PXN-pY31和PXN-pY118在角膜上皮及基質(zhì)層尤其是淺基質(zhì)層的表達(dá)略強(qiáng)，并與新生血管的生長(zhǎng)周期及Western blot檢測(cè)結(jié)果保持一致。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在角膜堿燒傷后，PXN-pY31和PXN-pY118可能通過(guò)某種方式影響著CNV的生成。因此，我們推測(cè)，在角膜病理性血管新生的狀態(tài)下，機(jī)體通過(guò)PXN酪氨酸磷酸化達(dá)到對(duì)血管新生的調(diào)控作用。然而，這些機(jī)制還遠(yuǎn)未明確。因此，監(jiān)測(cè)VEGF、FAK和PXN及下游蛋白的表達(dá)活性，才能更清晰地研究血管生成的機(jī)制。

目前，用于臨床的藥物主要包括抗炎藥物和抗VEGF藥物?？寡姿幬飸?yīng)用較早，副作用較多，在非炎癥性 CNV的治療中應(yīng)用受限。VEGF作為調(diào)控血管生成的關(guān)鍵因子，其靶向治療的研究得到廣泛關(guān)注[25]，一些以VEGF/VEGFR 信號(hào)通路為作用靶點(diǎn)的藥物，如貝伐單抗、雷珠單抗等，已經(jīng)被應(yīng)用于臨床治療眼部新生血管，許多新的靶點(diǎn)治療及抗血管生成的藥物也已相繼被發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)完成或正在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)。盡管沒(méi)有完全抑制CNV，且藥物長(zhǎng)期使用的安全性和有效性也有待反復(fù)臨床試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究來(lái)確保，但其短期隨訪結(jié)果令人振奮，人們期望設(shè)計(jì)出療效更好、更安全的抗血管生成藥物，最終能多方位并長(zhǎng)效地抑制及治療各種組織和器官的新生血管。因此，針對(duì)VEGF信號(hào)通路機(jī)制的深入研究，將有助于高選擇性的具有良好藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)藥物的研發(fā)，并為CNV的臨床治療帶來(lái)廣闊前景。

綜上所述，PXN可能參與并促進(jìn)了CNV的發(fā)生和發(fā)展，PXN-pY31和PXN-pY118表達(dá)均與CNV的生長(zhǎng)周期密切相關(guān)，由此推斷，PXN酪氨酸磷酸化與角膜CNV的發(fā)生發(fā)展有緊密的聯(lián)系，值得進(jìn)一步研究。