何 朵 吳 博 趙菊梅

作者單位：716000 延安 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院；延安市腫瘤防治研究重點(diǎn)研究室

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位［1-2］。而三陰性乳腺癌作為乳腺癌的一種特殊亞型，具有較高的腫瘤異質(zhì)性，易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且對內(nèi)分泌治療和分子靶向治療不敏感，化療成為三陰性乳腺癌治療的主要手段，但轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的三陰性乳腺癌易耐藥，因此亟需進(jìn)一步開發(fā)針對三陰性乳腺癌的新型化療藥物以及治療靶點(diǎn)［3-5］。ALDH是乳腺癌干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）最為可靠的標(biāo)志物，在乳腺癌干細(xì)胞表面高表達(dá)，且表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為三陰性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素［6-7］。鹽霉素（salinomycin，Sal）是一種羧基載體類鉀離子載體抗生素。研究表明鹽霉素作為一種新型的抗腫瘤藥物，能夠通過誘導(dǎo)凋亡而抑制多種癌細(xì)胞及癌干細(xì)胞生長［8-10］。但Sal對乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用以及是否與乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH的表達(dá)相關(guān)尚不明確。本研究觀察Sal對MDA-MB-231細(xì)胞生長、凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為三陰性乳腺癌治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231、MCF7、T47D購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；Sal購自上海安奈德化學(xué)技術(shù)中心；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；二亞基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；ALDEFLOUR kit購自加拿大StemCell公司；Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleaved-PARP抗體購自英國Abcam公司；Cleaved-Caspase-3抗體購自武漢三鷹公司。MTT購自Biosharp公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231置于含10%FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%密度時(shí)用胰酶消化傳代；每2～3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)胞中加入的Sal濃度分組：對照組 0 μmol/L Sal，以及不同濃度（1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L）的 Sal組。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測MDA-MB-231細(xì)胞增殖情況

取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×104/mL，96孔板每孔加入 100 μL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后按照 1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32 μmol/L的終濃度依次加入Sal，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以相同體積的培養(yǎng)基作為空白對照組。分別于24 h、48h、72 h每孔加 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），培養(yǎng) 4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm處各孔吸光度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）］×100%。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況

Sal作用48 h后，取各組對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，PBS清洗，離心后棄上清液，分別加入500μLBindingBuffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V 5 μL，室溫避光30 min，加入PI 5μL，避光反應(yīng)5～10 min，PBS清洗后離心棄上清液，加入400 μL Binding Buffer重懸，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測MCF7、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH的表達(dá)

取對數(shù)生長期MCF7、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，按照5×105/mL細(xì)胞濃度接種于6孔板，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液以及不同濃度（0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）Sal作用48 h。用ALDEFLUOR Buffer重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106/mL，DEAB 管中加入 5 μL DEAB；TEST管加入1 mL細(xì)胞，轉(zhuǎn)移0.5 mL至DEAB管，孵育25～45 min，離心棄上清液，300 μL ALDEFLUOR Buffer重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、Bax、PARP、Caspase-3的表達(dá)

Sal作用48 h后，取各組對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，收集細(xì)胞并提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h，分別加入凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、Bax、PARP、Caspase-3和內(nèi)參蛋白GAPDH等抗體，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1 h，ECL曝光顯影成像。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7 qRT-PCR檢測MDA-MB-231細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Bcl-2、Bax、PARP 及 Caspase-3 mRNA 的表達(dá)

Sal作用48 h后，取各組對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA，測定260/280 nm OD值，確定RNA純度及濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA。以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液共20 μL，反應(yīng)條件：95℃反應(yīng) 5 min預(yù)變性；95 ℃反應(yīng)20 s，58 ℃反應(yīng)20 s，72 ℃反應(yīng)20 s，72 ℃反應(yīng) 10 min，共 40 個(gè)循環(huán)，并采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.8 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析ALDH與凋亡相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性

在 TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）中下載乳腺癌組織及其癌旁正常組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)（n=1 218），以及與其對應(yīng)的臨床樣本信息資料。并根據(jù)所對應(yīng)的臨床信息進(jìn)一步篩選三陰性乳腺癌組織（n=306），分析ALDH與凋亡信號通路相關(guān)分子Bcl-2、Bax、PARP及Caspase-3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析，多重比較使用Dunnett′s t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)篩選ALDH高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，MCF7、T47D、MDAMB-231細(xì)胞的ALDH相對表達(dá)比例分別為2.44%、1.27%、4.34%，其中MDA-MB-231細(xì)胞的比例最高，見圖1。故選取MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 MCF7、T47D、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞ALDH表達(dá)情況Fig.1 Expression of ALDH in MCF7，T47D and MDA-MB-231 breast cancer cells

2.2 Sal對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

MTT 法檢測結(jié)果顯示，Sal在 24 h、48 h、72 h 均可以劑量依賴的方式抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F24=83.080，P24＜0.001；F48=41.810，P48＜0.001；F72=248.600，P72＜0.001），多重比較發(fā)現(xiàn)，2 μmol/L 組、4 μmol/L 組、8 μmol/L 組、16 μmol/L組、32 μmol/L組的細(xì)胞活力均低于對照組（均P＜0.01），見圖 2。而 16 μmol/L 組、32 μmol/L 組 24 h、48 h、72 h的細(xì)胞抑制率均低于50%，因此選擇2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L 作用 48 h 進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 Sal對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖的影響Fig.2 Effect of Sal on proliferation of breast cancer cell MDA-MB-231

2.3 Sal對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，Sal作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.080，P=0.004），進(jìn)一步多重比較發(fā)現(xiàn)，2 μmol/L組、4 μmol/L 組、8 μmol/L 組的細(xì)胞凋亡率均高于對照組（t2=13.110，P2=0.006；t4=11.290，P4=0.008；t8=7.185，P8=0.019），且Sal可濃度依賴的促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖3 Sal對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡的影響Fig.3 Effect of Sal on apoptosis of breast cancer cell MDA-MB-231

2.4 Sal對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，Sal作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Caspase-3、Bcl2、Bax、PARP mRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FCaspase-3=143.200，PCaspase-3＜0.001；FBcl-2=70.200，PBcl-2＜0.001；FBax=47.930，PBax＜0.001；FPARP=34.470，PPARP＜0.001），多重比較顯示，2 μmol/L 組、4 μmol/L 組、8 μmol/L 組 Bcl-2、PARP、Caspase-3mRNA的表達(dá)均低于對照組（均P＜0.05），Bax mRNA 表達(dá)均高于對照組（均 P＜0.05）。見圖 4。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，2 μmol/L 組、4 μmol/L 組、8 μmol/L 組 Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低，而PARP、Bax蛋白表達(dá)呈劑量依賴性增加。見圖5。

圖4 Sal對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Sal on the expression of apoptosis-related molecules MDA-MB-231 in breast cancer cells

2.5 Sal對乳腺癌MDA-MB-231腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH表達(dá)的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，Sal作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，各組乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=94.390，P＜0.001），多重比較顯示，2 μmol/L 組、4 μmol/L 組、8 μmol/L組ALDH表達(dá)均低于對照組（t2=6.672，P2=0.022；t4=9.844，P4=0.010；t8=102.800，P8＜0.001），且 Sal呈濃度依賴性抑制ALDH在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)。見圖5。

2.6 TCGA數(shù)據(jù)庫分析ALDH與凋亡相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性

TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ALDH與抗凋亡相關(guān)分子 Bcl-2（r=0.209，P=0.007）以及 Caspase-3（r=0.235，P=0.002）的表達(dá)呈正相關(guān)，與 Bax（r=-0.326，P＜0.001）及 PARP（r=-0.453，P＜0.001）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。見圖6。

圖5 Sal對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Sal on expression of surface marker ALDH in MDA-MB-231 breast cancer cell

圖6 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析ALDH與凋亡相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性Fig.6 Analysis of the correlation between ALDH and the expression of apoptosis-related molecules based on TCGA database

3 討論

Sal是從白色鏈霉菌發(fā)酵液中分離出的一種新的生物活性物質(zhì)，通過干擾細(xì)胞內(nèi)外陽離子（Na+、K+）平衡，改變滲透壓，殺死病原微生物，是一種典型的離子載體抗生素［11］。既往研究發(fā)現(xiàn)Sal能夠抑制多種癌細(xì)胞及干細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)其凋亡，抵抗耐藥［12］。本研究采用MTT法檢測不同時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h、72 h） 不同濃度（1～32 μmol/L）Sal作用 MDAMB-231細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)Sal可抑制細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀檢測Sal對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，同樣發(fā)現(xiàn)Sal能以劑量依賴的方式誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Western blot檢測結(jié)果顯示，Sal作用48 h后MDAMB-231細(xì)胞Caspase-3、PARP活化增多，Bax表達(dá)增加，而Bcl-2表達(dá)下降。以上結(jié)果表明Sal可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

ALDH是催化細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶，參與多種組織的分化與基因表達(dá)，表達(dá)相對穩(wěn)定，不易受外界因素干擾，是CSCs可靠的標(biāo)志物，可作為乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)，有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)［13］。研究表明ALDH活性降低可引起癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［14-15］。CANUTO等［16］通過ALDH抑制劑抑制ALDH的活性，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)過表達(dá)Bcl-2的肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的生長。NAKOPOULOU等［17］研究發(fā)現(xiàn)，ALDH降低的同時(shí)伴Caspase-3活性下降。ZHANG等［18］亦發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ALDH能夠保護(hù)細(xì)胞免受由過氧化應(yīng)激引起的Caspase-3啟動(dòng)的凋亡。為進(jìn)一步探討Sal是否通過乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH發(fā)揮細(xì)胞凋亡抑制作用，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測Sal對MDA-MB-231乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH表達(dá)的影響，結(jié)果顯示Sal可以濃度依賴的方式抑制ALDH在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)。采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析細(xì)胞凋亡相關(guān)分子與ALDH之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示ALDH與Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)，而與Bax、PARP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。其中PARP剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，亦是 Caspase-3激活的指標(biāo)［19］。而Bcl-2、Bax不但可作為Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制，參與對Caspase-3活性的調(diào)節(jié)，還可作為Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3的下游［20-21］，二者在細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)過程中既相互聯(lián)系又相互制約［22-23］。因此認(rèn)為，Sal可能通過靶向調(diào)控ALDH的表達(dá)從而促進(jìn)Bcl-2與Bax的相互作用，進(jìn)一步激活下游底物PARP，Caspase-3的表達(dá)，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而影響腫瘤生長。

綜上所述，Sal可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，可能通過下調(diào)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物ALDH表達(dá)實(shí)現(xiàn)，但Sal在發(fā)揮較強(qiáng)抗腫瘤活性的同時(shí)，其顯著的神經(jīng)和肌肉毒性也不容忽視［24-25］，因此仍需進(jìn)一步研究以提高其抗腫瘤活性、降低細(xì)胞毒性，從而為Sal成為一種新型的抗腫瘤藥物提供依據(jù)。