趙 鄭 逄子瑤 徐麗萍 陳勇華 楊 瑛

作者單位：264000 煙臺(tái) 青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院婦科

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率高，且呈年輕化發(fā)展趨勢(shì)［1］。宮頸癌患者尤其是中晚期宮頸癌患者的局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后較差，5年生存率為50%～60%［2］。研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后與原癌基因及抑癌基因密切相關(guān)［3］。因此，篩選與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，對(duì)其早期診斷和預(yù)后判斷，以及精準(zhǔn)治療具有重要意義。腫瘤相關(guān)基因 PRR11（priline-rich 11）和 SKA2（spindle and kinetochore associated complex subunit 2）均定位于染色體17q22區(qū)，兩者共享一個(gè)獨(dú)特的雙向啟動(dòng)子，組成獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄單元，是一個(gè)典型的“基因?qū)Α?。目前研究發(fā)現(xiàn)PRR11-SKA2“基因?qū)Α眳⑴c肺癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［4-5］，但兩者在宮頸癌中的作用尚未知。本研究檢測(cè)PRR11和SKA2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為宮頸癌的預(yù)后評(píng)估及靶向治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2012年1月—2015年12月于青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院行宮頸癌根治術(shù)切除的289例宮頸癌患者的臨床資料，獲取所有患者癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織（距癌灶邊緣2 cm處）標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷為宮頸癌；⑵術(shù)前均未接受放化療；⑶臨床病理資料完整。排除合并其他惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾、感染性疾病等。289例患者平均年齡（44.7±7.1）歲（范圍：26～68歲）；臨床 FIGO 分期：Ⅰ期140例，Ⅱ期93例，Ⅲ期54例，Ⅳ期2例；低分化52例，中分化196例，高分化41例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移130例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：201702368），患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化檢測(cè)PRR11和SKA2蛋白的表達(dá)

兔抗人PRR11多克隆抗體（稀釋比例1∶200）、兔抗人SKA2單克隆抗體（稀釋比例1∶200）購自上海長島生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG購自上海滬峰化工有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）試劑盒購自美國Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。組織樣本固定、包埋、切片，脫蠟，進(jìn)行SP法免疫組化染色。鏡檢觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法判定結(jié)果，若意見不一致則由本科室另一主任醫(yī)師最終判定。每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)取200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果判定：PRR11蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，SKA2蛋白定位于細(xì)胞核，均以呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，最終染色結(jié)果以陽性細(xì)胞數(shù)所占的比例及染色強(qiáng)度綜合判定。染色強(qiáng)度計(jì)分依據(jù)：無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽性細(xì)胞數(shù)所占的比例計(jì)分依據(jù)：無陽性細(xì)胞計(jì)0分，＜25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。以上兩項(xiàng)計(jì)分相乘后，9～12分為強(qiáng)陽性（+++），5～8分為陽性（++），1～4分判弱陽性（+），0分則為陰性（-）。

1.3 隨訪

采取門診、電話、電子郵件及信件等方式進(jìn)行隨訪，每月隨訪1次，隨訪截至2018年12月26日。隨訪時(shí)間為6～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為22個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為24.4個(gè)月，無失訪病例。統(tǒng)計(jì)患者生存情況?？偵妫╫verall survival，OS）定義為接受手術(shù)治療日開始至患者死亡或隨訪截止的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；PRR11和SKA2表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，組間生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cox等比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響預(yù)后因素，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其對(duì)應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRR11和SKA2在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，PRR11蛋白陽性信號(hào)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，SKA2蛋白定位于細(xì)胞核。見圖1。在宮頸癌組織和癌旁正常組織中，PRR11陽性表達(dá)率分別為 60.21%（174/289）和 16.96%（49/289），SKA2陽性表達(dá)率分別為 69.55%（201/289）和37.37%（108/289）。PRR11和SKA2在宮頸癌組織中陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織（χ2=114.081，P＜0.001；χ2=60.143，P＜0.001）。Spearman 相關(guān)分析顯示，宮頸癌組織中PRR11和SKA2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.725，P＜0.001）。

2.2 PRR11和SKA2蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

289例宮頸癌組織中，PRR11和SKA2蛋白的表達(dá)與患者的FIGO分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），但未發(fā)現(xiàn)與年齡、腫瘤直徑、肌層浸潤和脈管浸潤有關(guān)（P＞0.05）。見表1。

圖1 PRR11和SKA2在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)（SP×400）Fig.1 Expression of PRR11 and SKA2 in cervical cancer tissues and adjacent normal tissues（SP×400）

表1 PRR11和SKA2蛋白的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（n）Tab.1 Relationship between the expression of PRR11 and SKA2 proteins and the clinicopathological characteristics of patients with cervical cancer（n）

2.3 PRR11和SKA2蛋白表達(dá)與宮頸癌患者OS的關(guān)系

本組患者3年總生存率為84.78%。PRR11陽性和陰性表達(dá)患者的3年總生存率分別為78.16%和94.78%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.293，P=0.002）；SKA2陽性和陰性表達(dá)患者的3年總生存率分別為82.09%和90.91%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.323，P=0.036）；PRR11、SKA2均為陰性表達(dá)的患者3年總生存率為95.35%，PRR11陰性、SKA2陽性表達(dá)患者3年總生存率為94.44%，PRR11陽性、SKA2陰性表達(dá)患者3年總生存率為86.67%，PRR11、SKA2均陽性表達(dá)的患者3年總生存率為75.19%，PRR11、SKA2均陽性表達(dá)的患者3年總生存率明顯低于其他交互表達(dá)方式（均 P＜0.05）。見圖 2。

單因素Cox回歸模型分析顯示，年齡、FIGO分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PRR11陽性表達(dá)和SKA2陽性表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。多因素Cox回歸模型分析顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ～Ⅳ期、PRR11陽性表達(dá)和SKA2陽性表達(dá)是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.698，95%CI：1.369～2.876，P ＜0.001；HR=2.392，95%CI：1.294～3.596，P＜0.001；HR=1.597，95%CI：1.024～2.302，P＜0.001）。見表2。

3 討論

圖2 PRR11和SKA2蛋白表達(dá)與宮頸癌患者總生存率的關(guān)系Fig.2 Relationship between PRR11 and SKA2 protein expression and overall survival in patients with cervical cancer

SKA2位于PRR11上游，與PRR11共享一個(gè)典型的雙向啟動(dòng)子，也是與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的基因，在腫瘤組織中異常表達(dá)，可能發(fā)揮癌基因作用［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)PRR11參與細(xì)胞周期調(diào)控和增殖，與前列腺癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-12］。在結(jié)直腸癌組織中PRR11高表達(dá)，且可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移［13］。SKA2在食管癌中亦表現(xiàn)出同樣的作用［14］。本研究采用免疫組化檢測(cè)宮頸癌組織及癌旁正常組織中PRR11和SKA2的表達(dá)情況，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)PRR11和SKA2在宮頸癌組織中高表達(dá)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。提示兩者可能參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展，可能是宮頸癌診斷的有效指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。

表2 宮頸癌患者總生存相關(guān)因素的單因素及多因素分析Tab.2 Univariable and multivariable analysis of factors related to overall survival in patients with cervical cancer

人類基因組超過10%的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間隔小于1 000 bp堿基，共享一個(gè)雙向啟動(dòng)子［15］。雙向啟動(dòng)子可參與DNA損傷修復(fù)，維持基因組穩(wěn)定性，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。肺癌組織中PRR11和SKA2的表達(dá)水平明顯高于正常組織，且在肺癌MCF-7細(xì)胞中不管單獨(dú)沉默PRR11或SKA2基因還是聯(lián)合沉默2個(gè)基因均能抑制肺癌細(xì)胞的增殖活性，聯(lián)合沉默時(shí)抑制作用更明顯［16］。WANG 等［4］亦報(bào)道“基因?qū)Α盤RR11-SKA2可能參與糖皮質(zhì)激素受體相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，SKA2作為PRR11的上游基因，兩者存在調(diào)控關(guān)系。在胰腺癌細(xì)胞中敲除SKA2基因表達(dá)能降低PRR11的活性，阻滯細(xì)胞于S期，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長［17］。在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)SKA2啟動(dòng)子區(qū)可與HIF-1直接結(jié)合而調(diào)節(jié)PRR11表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管新生及成熟，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展侵襲及轉(zhuǎn)移［5］。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PRR11和SKA2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且與患者的FIGO分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示PRR11和SKA2高表達(dá)可影響宮頸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移，且可能具有協(xié)同作用。在食管癌組織中亦發(fā)現(xiàn)PRR11表達(dá)與患者分化程度及轉(zhuǎn)移相關(guān)［18］；SKA2蛋白表達(dá)與乳腺癌患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［19］，均與本研究結(jié)果一致。此外，CAI等［10］研究發(fā)現(xiàn)PRR11高表達(dá)是鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。BIAN等［20］報(bào)道SKA2高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者較差的預(yù)后相關(guān)。本研究Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，PRR11、SKA2陽性表達(dá)患者的3年總生存率均低于陰性表達(dá)者及兩者的其他交互表達(dá)方式；多因素分析顯示PRR11陽性表達(dá)和SKA2陽性表達(dá)是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示PRR11、SKA2高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)，可能是潛在的預(yù)后判斷指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PRR11和SKA2在宮頸癌組織中陽性表達(dá)率較高且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。PRR11和SKA2陽性表達(dá)與宮頸癌患者FIGO分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，也是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此檢測(cè)其表達(dá)水平可能有助于宮頸癌診斷和預(yù)后評(píng)估，但兩者之間具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。