金 松 倉 宇 于躍平

作者單位：650021 昆明 云南省第二人民醫(yī)院泌尿外科

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢［1-2］。膀胱癌預(yù)后較好，但易復(fù)發(fā)及發(fā)展成肌層浸潤性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer，MIBC）。而 MIBC侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，預(yù)后較差，5年生存率不足50%［3-4］。反義長鏈非編碼RNA（anti-sense long non-coding RNA）是一類長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA），較其他類型的lncRNA穩(wěn)定，定位更自由［5-6］。有研究報(bào)道，特定的lncRNA在膀胱癌中表達(dá)異常，且與膀胱癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)［7］。反義長鏈非編碼RNA作為一種特定的lncRNA，能通過不同機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)。lncRNA RAB11B-AS1是一種反義lncRNA，定位于19q13.2，長1022 bp，是具有3個(gè)外顯子的lncRNA，目前研究顯示lncRNA RAB11B-AS1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌或致癌作用［8］。但lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌中的作用尚未明確。本研究檢測lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌組織中的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為膀胱癌的預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年10月—2014年2月于云南省第二人民醫(yī)院泌尿外科行腹腔鏡膀胱根治性切除術(shù)的膀胱癌患者作為研究對象，收集膀胱癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織（距病灶＞5 cm且鏡檢未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞）。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)膀胱癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］診斷為膀胱癌；⑵術(shù)前未行放療或化療；⑶臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并其他惡性腫瘤者；⑵合并肝、腎、心臟等疾病者；⑶合并自身免疫疾病者；⑷復(fù)發(fā)性膀胱癌者。共83例患者符合標(biāo)準(zhǔn)納入分析，其中男性59例；年齡37～75歲，平均年齡（54.31±7.86）歲。按照《膀胱癌診斷治療指南》臨床TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscular invasive bladder cancer，NMIBC）Tis～T1 期 35 例，MIBC T2～T4期48例；低分化46例，中、高分化37例。本研究經(jīng)云南省第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.2 qRT-PCR法檢測膀胱癌組織中l(wèi)ncRNA RAB11BAS1的表達(dá)

RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京天根生化有限公司；qRT-PCR試劑盒購自德國QIAGEN公司；Bio-Rad PCR儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，檢測RNA純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度；將所得RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。qRT-PCR按照qRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL 2×SYBR Mix，上、下游引物各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，dH2O 7 μL，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95℃30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。lncRNA RAB11B-AS1 上游引物：5′-CCATGGACCCTTGCGAGAT-3′，下游引物：5′-CAAAGTCCATGTAAACATGTTCCC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCTTACTTCTCATGG-3′。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA RAB11B-AS1的相對表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)及隨訪

收集患者性別、年齡、TNM分期、腫瘤大小、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況等臨床資料，并通過電話或郵件隨訪，每隔3個(gè)月隨訪1次，隨訪截至2019年3月，記錄患者的生存狀態(tài)及總生存時(shí)間。中位隨訪時(shí)間48個(gè)月，無失訪病例?？偵嫫诙x為自確診至隨訪截止日期或死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；分類資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用多因素Cox回歸分析lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系；以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌和癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織（1.17±0.32 vs 2.09±0.74，t=10.396，P＜0.001），見圖 1。

圖1 lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA RAB11B-AS1 in bladder cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)lncRNARAB11B-AS1表達(dá)水平的中位數(shù)（1.20）將患者分為高表達(dá)組（≥1.20）和低表達(dá)組（＜1.20），其中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1表達(dá)水平與TNM分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），但未發(fā)現(xiàn)其與患者年齡、性別和腫瘤大小有關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship between the expression of lncRNA RAB11B-AS1 and clinicopathological characteristics in bladder cancer patients［n（%）］

2.3 lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)水平與膀胱癌患者總生存期關(guān)系

83例膀胱癌患者至隨訪結(jié)束共生存39例，5年總生存率為46.99%。lncRNA RAB11B-AS1高表達(dá)患者術(shù)后5年總生存率為62.22%，低表達(dá)患者為26.32%；兩組患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.420，P＜0.001）。見圖 2。

2.4 影響膀胱癌患者預(yù)后的因素分析

單因素Cox回歸分析顯示，lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)、TNM分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與膀胱癌患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05），見表2。多因素Cox回歸分析顯示，lncRNA RAB11B-AS1低表達(dá)是膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.126，95%CI：1.058～1.200，P＜0.001），見表 3。

圖2 lncRNA RAB11B-AS1高表達(dá)和低表達(dá)膀胱癌患者的生存曲線Fig.2 Survival curves of bladder cancer patints with lncRNA RAB11B-AS1 high and low expression

表2 影響膀胱癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析Tab.2 Univariable Cox regression analysis of prognosis in patients with bladder cancer

表3 影響膀胱癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Tab.3 Multivariable Cox regression analysis of prognosis in patients with bladder cancer

3 討論

膀胱癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，包含遺傳因素、基因突變或分子水平的變化等。目前膀胱癌臨床診斷中尚缺乏有效的腫瘤標(biāo)志物，治療亦未取得明顯進(jìn)展。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度＞200 nt的非編碼蛋白質(zhì)RNA分子，可從轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等多個(gè)方面發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［10-11］。反義lncRNA作為一種lncRNA備受關(guān)注，可通過調(diào)節(jié)其正義基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。lncRNA RAB11B-AS1為反義lncRNA，熒光素酶報(bào)告基因檢測表明，RAB11B-AS1可通過反義配對調(diào)控RAB11B基因表達(dá)，二者的啟動(dòng)子序列反向互補(bǔ)。RAB11B是RAS癌基因家族成員之一，該基因家族在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化能力中發(fā)揮重要作用，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞浸潤、擴(kuò)散和凋亡的能力［12-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA RAB11B-AS1在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)lncRNA RAB11B-AS1可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，lncRNA RAB11B-AS1可能成為骨肉瘤的潛在治療靶標(biāo)［14］。NIU 等［15］報(bào)道lncRNA RAB11B-AS1 表達(dá)水平與腫瘤血管生成及乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究檢測膀胱癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA RAB11B-AS1的表達(dá)，亦發(fā)現(xiàn)lncRNA RAB11B-AS1在癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，且lncRNA RAB11B-AS1表達(dá)與患者TNM分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明lncRNA RAB11B-AS1可能參與膀胱癌的發(fā)生，且影響膀胱癌的發(fā)展進(jìn)程，與上述研究結(jié)果一致。有研究指出，RAB11B可通過整合素α5β1激活RCP蛋白，促進(jìn)細(xì)胞遷移［16］。lncRNA RAB11B-AS1也可能通過下調(diào)RAB11B表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

馮麗萍等［8］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA RAB11B-AS1 在胃癌組織中表達(dá)明顯高于正常胃組織，且高表達(dá)患者中位無進(jìn)展生存期及總生存期均低于低表達(dá)患者，lncRNA RAB11B-AS1是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，可能參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中，膀胱癌患者術(shù)后5年總生存率為46.99%，lncRNA RAB11BAS1低表達(dá)患者5年總生存率低于高表達(dá)患者，提示lncRNA RAB11B-AS1低表達(dá)的膀胱癌患者預(yù)后較差。進(jìn)一步行多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA RAB11B-AS1低表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示監(jiān)測lncRNA RAB11B-AS1水平有助于早期準(zhǔn)確評估膀胱癌患者預(yù)后狀況，從而實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)延長生存時(shí)間。

綜上所述，lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與TNM分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，且其低表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，lncRNA RAB11B-AS1有望成為膀胱癌診斷及預(yù)后評估指標(biāo)。但本研究為單中心回顧性研究，且樣本量有限，后續(xù)仍需開展前瞻性、多中心、大樣本研究加以驗(yàn)證。