田思敏，陳小雪，韓北忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

飲酒的傳統(tǒng)古來(lái)有之，有報(bào)告稱全世界最早的酒精飲品誕生于中國(guó)[1]，研究表明少量飲酒能降低死亡率[2]，但是飲酒過(guò)度會(huì)損害健康[3]。中國(guó)的酒精性肝疾病患者正在增多[4]，健康飲酒的基礎(chǔ)教育成為當(dāng)務(wù)之急。飲酒導(dǎo)致肝損傷的背景是氧化應(yīng)激上升，其中長(zhǎng)期酗酒和過(guò)量狂飲都存在有害性，為此人們正在進(jìn)行多方面的研究[5-7]。研究結(jié)果顯示酒精在通過(guò)肝臟代謝的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧類(lèi)（reactive oxygen species，ROS）[8]，過(guò)度的活性氧會(huì)使肝臟中的抗氧化物質(zhì)枯竭，導(dǎo)致氧化應(yīng)激并由此導(dǎo)致細(xì)胞損傷。酒精性肝損傷在人體上的癥狀有：肝臟脂肪蓄積、肝臟纖維化、肝硬化，甚至肝癌。酒精在人體內(nèi)主要通過(guò)乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）來(lái)分解，有報(bào)告稱ADH和ALDH可減輕氧化應(yīng)激[9]，已有研究表明，通過(guò)攝取醋酸菌可以減輕攝取乙醇對(duì)肝臟造成的損傷[9]。

醋是自古以來(lái)餐桌上常用的調(diào)味料，除了具有調(diào)味的功能之外，其還具有抑制血壓升高和促進(jìn)鈣吸收等保健功能，還有報(bào)告稱一部分的醋具有醒酒[10]和減輕酒精性肝損傷的功能[11-12]。醋是通過(guò)對(duì)酒精進(jìn)行醋酸發(fā)酵制得的，其代謝是通過(guò)ADH和ALDH途徑進(jìn)行的。醋的制造工藝與人體酒精代謝的類(lèi)似性，或許在醋的制造過(guò)程中產(chǎn)生的具有ADH和ALDH活性的組分，能夠促進(jìn)酒精分解，減輕酒精性肝損傷。前期研究已經(jīng)證明攝入醋酸菌可減輕因使用乙醇誘發(fā)的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高和脂肪在小鼠肝臟中的蓄積[13]。本研究以“醋酸菌粉末”（acetic acid bacterial powder）為研究對(duì)象，建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，評(píng)估其對(duì)急性攝入酒精引起的肝脂質(zhì)蓄積和氧化損傷的影響，為開(kāi)發(fā)新型減緩酒精性肝損傷的營(yíng)養(yǎng)輔助食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品信息

醋酸菌粉末：由丘比株式會(huì)社提供，-20 ℃冷凍保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

選用北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2016-0006）提供的無(wú)特定病體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性美國(guó)癌癥研究所（institule of cancer research，ICR）小鼠，共25只，體質(zhì)量28～30 g，適應(yīng)環(huán)境5 d后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按體質(zhì)量進(jìn)行隨機(jī)分組，每組5只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和儲(chǔ)存以及疼痛緩解標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，經(jīng)CAIQtest動(dòng)物研究委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

飼養(yǎng)條件：溫度：20～26 ℃；相對(duì)濕度：40%～70%；亮暗循環(huán)：明暗交替時(shí)間12 h/12 h，早8點(diǎn)到晚8點(diǎn)。

飼料：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0015）。

1.1.3 試劑

鐵氰化鉀（純度＞99.0%）、乙醇（純度＞99.5%）、檸檬酸（純度＞99.0%）、磷酸氫二鈉（純度＞99.0%）、硫酸鐵（III）n水合物（60.0%～80.0%）、磷酸：日本關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社；十二烷基硫酸鈉（純度＞95.0%）：日本FUJIFILM公司；麥基爾文緩沖液（pH=5）由檸檬酸和磷酸氫二鈉制備；Dupanol溶液由硫酸鐵（III）n水合物、十二烷基硫酸鈉和磷酸配制。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒：南京建成科技有限公司；甘油三酸酯（triglyceride，TG）測(cè)定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyHIM多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司（BioTek）、TBA120FR全自動(dòng)生化分析儀：日本東芝有限公司；S10型手提式高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司）、CM1850冰凍切片機(jī)：德國(guó)Leica有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道[14]改良了乙醇的給予方法。連續(xù)5 d的適應(yīng)期結(jié)束后，試驗(yàn)前1d，動(dòng)物稱質(zhì)量，實(shí)施預(yù)飼養(yǎng)后將其分為對(duì)照組，乙醇組，樣品7.5 mg/kg組，15.0 mg/kg組，45.0 mg/kg組，共計(jì)5組。陰性對(duì)照組灌胃給予植物油（0.01mL/10 g）；乙醇組灌胃給予植物油（0.01 mL/10 g）和體積分?jǐn)?shù)50%乙醇（0.12 mL/10 g）；乙醇＋醋酸菌粉末組灌胃給予體積分?jǐn)?shù)50%乙醇（0.12 mL/10 g）和三種不同劑量的受試樣品。禁食不禁水16 h，稱質(zhì)量后處死動(dòng)物，稱體質(zhì)量。

1.3.2 生化學(xué)分析

取0.5 g肝臟制成10%肝勻漿，取0.1 mL肝勻漿液參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定MDA含量，10%肝勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH的含量，取上清液0.5 mL使用全自動(dòng)生化儀測(cè)定TG含量。

1.3.3 組織學(xué)分析

從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，油紅O染色[15]，從肝臟的一端視野開(kāi)始記錄細(xì)胞的病理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個(gè)組織切片。

1.3.4 乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）酶活性測(cè)定

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道[16]改良了酶活性測(cè)定方法。用微量吸管快速添加100 μL 醋酸菌粉末溶液，將空白樣換成純水100 μL。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放在微量恒溫器中（35 ℃）。5 min后，用微量吸管快速加入100 μL 0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放回微量恒溫器（35 ℃）。按一定間隔（10～20 s左右）進(jìn)行添加。20 min后，用微量吸管快速加500 μL Dupanol溶液。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放在常溫下。所有樣品添加Dupanol溶液后，用微量吸管吸取反應(yīng)液400μL，添加在準(zhǔn)備好的1 000μL純水中。用觸摸式磁力攪拌器輕輕攪拌，放在常溫下待測(cè)定。添加Dupanol 20 min后，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)660 nm下的吸光度值。以鐵氰化鉀含量（x）為橫坐標(biāo)，OD660nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 酶活性值計(jì)算

在37 ℃條件下，在1 min內(nèi)將1 μmol乙醇氧化所需要的酶量為1 U。將0.1 mL 1 mg/mL的醋酸菌粉末溶液稀釋D倍，反應(yīng)20 min后進(jìn)行活性測(cè)定，醋酸菌粉末底物為乙醛時(shí)，比酶活計(jì)算公式如下：

比酶活（U/mg干細(xì)胞）=A/d×D/20

式中：A為波長(zhǎng)660 nm處的吸光度值，d為鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，D為稀釋倍數(shù)。

底物為乙醇時(shí)，會(huì)通過(guò)ADH分節(jié)生成乙醛，因此同時(shí)會(huì)檢出ALDH活性。這里假設(shè)活性值的1/2是ADH活性。如果只關(guān)注醋酸菌粉末量，比酶活計(jì)算公式如下：

比酶活（U/mg干細(xì)胞）=A/d×0.1×1/T×1/E

式中：T為反應(yīng)時(shí)間，min；E為醋酸菌粉末質(zhì)量，mg。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用方差分析，計(jì)算F值，F(xiàn)值＜F0.05，則各組均數(shù)間無(wú)顯著性差異；F值≥F0.05，P≤0.05，則各組均數(shù)間存在顯著性差異。用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量水平

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量的測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其體質(zhì)量在各劑量組與乙醇組間比較，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的小鼠體質(zhì)量差異對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響。

表1 小鼠體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of body mass of mice

2.2 肝臟TG水平及油紅O染色

甘油三酯（TG）是人體脂質(zhì)的主要組成成分，血清中TG含量是誘發(fā)心血管疾病的危險(xiǎn)因素，TG含量越高誘發(fā)心血管疾病的可能性越大[7，17]。小鼠肝勻漿TG含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同處理組對(duì)小鼠肝臟甘油三酸脂的影響Fig.1 Effects of different treatment groups on triglycerides in mice liver

由圖1可見(jiàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乙醇組與對(duì)照組比較，肝臟TG濃度顯著升高（P＜0.01），可判定造模成功。1次灌胃給予受試物后，醋酸菌粉末給予組的TG水平低于乙醇給予組，差異具有顯著性（P＜0.01），且45.0 mg/kg組小鼠的TG水平幾乎與空白對(duì)照組持平。

取不同處理組的小鼠肝臟，經(jīng)冰凍切片油紅O染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理組小鼠的油紅染色結(jié)果（×40）Fig.2 Oil red staining results in different treatment groups of mice

由圖2可知，對(duì)照組小鼠肝臟脂滴形成較少，細(xì)胞呈散在分布；乙醇組小鼠肝臟內(nèi)彌漫性脂肪變性，大部分肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不等、分布不均的脂滴空泡，部分融合呈片狀并分布于肝細(xì)胞內(nèi)，脂滴在肝臟中的分布、范圍均高于對(duì)照組；45.0 mg/kg組脂肪變性情況有所減輕，脂滴空泡較小，但仍呈彌漫性分布。通過(guò)組織學(xué)分析，乙醇組小鼠肝臟中存在脂質(zhì)蓄積的現(xiàn)象，與乙醇組相比，45.0 mg/kg組小鼠肝臟中脂質(zhì)蓄積程度較輕，說(shuō)明醋酸菌粉末對(duì)酒精引起的脂質(zhì)蓄積具有緩解作用。

本研究使用的急性模型是用單次喂食0.12 mL/10 g的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇來(lái)模擬過(guò)量狂飲。急性過(guò)度攝入乙醇導(dǎo)致的肝臟脂肪蓄積是短暫可逆的[17]。結(jié)果表明，醋酸菌粉末具有減輕因過(guò)量狂飲導(dǎo)致的肝臟脂肪蓄積和氧化應(yīng)激的可能性。因此攝入醋酸菌粉末會(huì)有效減輕日常攝入酒精飲料導(dǎo)致的肝臟脂肪蓄積。

2.3 肝臟MDA及GSH水平

已有研究闡明，為了應(yīng)對(duì)乙醇代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，抗氧化物質(zhì)GSH會(huì)減少[17]。不同處理組的小鼠肝臟MDA以及GSH水平見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠中肝臟丙二醛、谷胱甘肽水平Table 2 Levels of malonaldehyde andglutathione in mice liver of each groups

由表2可見(jiàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乙醇組與對(duì)照組比較，肝臟MDA濃度顯著升高（P＜0.05），GSH濃度顯著降低（P＜0.05），可判定造模成功。1次灌胃給予受試物后，15.0 mg/kg組以及45.0 mg/kg組的GSH水平高于乙醇組，差異均具有極顯著性（P＜0.01）；其MDA水平在各劑量組與乙醇組間比較，差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。

在本研究中，醋酸菌粉末對(duì)抗氧化物質(zhì)GSH的減少有抑制作用，卻不影響氧化生成物MDA。這是因?yàn)閷?duì)氧化應(yīng)激的防御反應(yīng)途徑有多種，GSH與MDA并非一一對(duì)應(yīng)關(guān)系[18]，具體的代謝機(jī)理還有待進(jìn)一步闡明。

2.4 醋酸菌粉末酶活性測(cè)定以及作用效果

鐵氰化鉀的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.194 7x-0.002 7，二者線性良好（R2=0.999 4）。本研究中測(cè)定的醋酸菌粉末的ADH和ALDH活性分別是0.48 U/mg和1.38 U/mg。

圖3 鐵氰化鉀的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of potassium ferricyanide

此次試驗(yàn)中使用的小鼠體質(zhì)量約30 g，胃排泄時(shí)間約180 min[19]。根據(jù)此次喂食的乙醇量與酶活性進(jìn)行換算，推測(cè)醋酸菌粉末中的酶分解了喂食的180 mg乙醇中的約0.9～5.5 mg（占喂食量的0.5%～3.0%）。將這一結(jié)果與醋酸菌粉末的作用強(qiáng)度（減輕肝臟TG蓄積30%～55%）進(jìn)行對(duì)比，可以推測(cè)醋酸菌粉末依靠ADH和ALDH對(duì)乙醇的分解作用，以及ADH和ALDH對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的減輕作用[9，20]，有助于減輕肝臟TG蓄積。結(jié)果表明，在單次喂食乙醇的同時(shí)喂食醋酸菌粉末，可減輕因乙醇導(dǎo)致的肝臟脂肪蓄積。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)模擬急性酒精攝入，構(gòu)建動(dòng)物模型評(píng)估了醋酸菌粉末對(duì)急性攝入酒精引起的肝脂質(zhì)蓄積和氧化損傷的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，乙醇組肝臟中TG、MDA濃度顯著升高（P＜0.05），GSH濃度顯著降低（P＜0.05），小鼠肝臟脂肪變性嚴(yán)重；（乙醇＋45.0 mg/kg醋酸菌粉末）組的TG濃度顯著低于乙醇組（P＜0.01），GSH濃度極顯著高于乙醇組（P＜0.01）；脂肪變性情況有所減輕；各劑量組的MDA濃度與乙醇組比較，差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。醋酸菌粉末的ADH和ALDH酶活性分別為0.48 U/mg和1.38 U/mg。攝入醋酸菌粉末可以減輕急性攝入酒精引起的肝脂質(zhì)蓄積和氧化損傷。

研究報(bào)告稱有數(shù)種能夠減輕酒精性肝損傷的天然成分，它們的作用大都是憑借抗氧化能力發(fā)揮的。而醋酸菌粉末與其他成分相比，其獨(dú)到之處是能夠降低呼氣和血液中的酒精濃度。將醋酸菌粉末與具有抗氧化作用的天然成分相結(jié)合，有望發(fā)揮加乘效果。進(jìn)一步減輕因過(guò)量狂飲導(dǎo)致的肝臟脂肪蓄積和氧化應(yīng)激現(xiàn)象。