王威威，劉婷，陳果，姬忠華 ，趙增志，黃宇，陳艷艷，石夢(mèng)雅，何秀苗*，韋平*

(1.廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，廣西 南寧 530005；2.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西多糖材料與改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006)

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起雛雞的免疫抑制性疾病，主要侵害淋巴組織，特別是法氏囊，并給世界養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。已知IBDV存在2個(gè)血清型，血清Ⅰ型可引起雞的長(zhǎng)期免疫抑制并導(dǎo)致死亡，可分為經(jīng)典株(classical, cIBDV)、抗原變異株(antigenic variant, avIBDV)和超強(qiáng)毒株(very virulent, vvIBDV)，而血清Ⅱ型對(duì)雞不致病[2]。vvIBDV于20世紀(jì)80年代出現(xiàn)，可從接種過(guò)疫苗的雞群或具有母源抗體的雞群中分離出來(lái)[3-4]，當(dāng)前vvIBDV毒株是我國(guó)主要流行的病毒。

IBDV是雙鏈RNA病毒，屬于雙 RNA 病毒科(Birnaviridae)禽雙 RNA 病毒屬(Avibirnavirus)，其基因組由 A、B 兩個(gè)節(jié)段組成[5]。A節(jié)段編碼VP2(外衣殼蛋白)、VP3(內(nèi)衣殼蛋白)、VP4(蛋白酶)和VP5(非結(jié)構(gòu)蛋白)[6-7]。VP2蛋白量約是病毒總量的51%，是病毒的主要宿主保護(hù)性抗原并攜帶所有中和表位，含有能誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體能被動(dòng)地保護(hù)宿主免受IBDV的感染[8], 其中一些抗原決定簇被認(rèn)為與抗原變異、病毒毒力和細(xì)胞凋亡有關(guān)[9]。VP1蛋白由B節(jié)段編碼，具有 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶活性，與病毒RNA的復(fù)制和毒力有關(guān)，已成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)[10-11]。

目前研究人員多認(rèn)為VP2具有良好的免疫原性，并已在多種表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了VP2蛋白，VP1基因的表達(dá)和功能研究較少[12]。前人研究發(fā)現(xiàn)雞IBDV野毒株的VP2和VP1基因組片段不斷發(fā)生變化并出現(xiàn)多種類(lèi)型的重排毒株[13]。這些重排毒株的毒力和抗原性與不同來(lái)源VP1片段的重排或重組有關(guān)，并認(rèn)為可通過(guò)與VP2片段協(xié)同增強(qiáng)病毒的毒力[14-15]。因此，本研究選擇將VP2和VP1抗原性和親水性較好的區(qū)域串聯(lián)以探究串聯(lián)重組蛋白的反應(yīng)原性，以及為了獲得IBDV特異性檢測(cè)的VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白抗原，利用所建立的原核表達(dá)系統(tǒng)分別成功表達(dá)VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)蛋白，為IBDV特異性檢測(cè)方法和新型亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及IBDV陽(yáng)性血清

廣西地區(qū)流行代表株NN1172(GenBank ID: JQ398618 和 KC968868)為廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所自行分離保存[13]，該分離株抗原性和免疫保護(hù)性是近年來(lái)最好的[15]；DH5α和BL21菌株購(gòu)置天根生化科技有限公司；傳染性支氣管炎病毒(IBV)、呼腸孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)、新城疫病毒(NDV)和雞抗IBDV陽(yáng)性血清均為作者所在實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 主要試劑

Trizol RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；PrimeSTAR MAX DNA Polymerase、快切酶QuickCutKpnⅠ、QuickCutXhoⅠ、QuickCutEcoRⅠ、T4連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；通用型DNA純化回收試劑盒、Mini Plasmid Kit、DAB顯色試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗雞IgY購(gòu)置Abbkine公司；IPTG購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)蛋白純化試劑盒，購(gòu)自金斯瑞生物公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上公布的IBDV序列，分別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增IBDV VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因的引物(見(jiàn)表1)。并通過(guò)DNASTAR軟件分析VP2和VP1基因抗原性和親水性相對(duì)較好的區(qū)段(VP2的1aa～223aa和VP1的690aa～881aa)。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 IBDV VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因的擴(kuò)增引物

基因引物序列(5′→3′)片段大小/bp工具酶VP2VP2-FCGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCCVP2-RCGGCTCGAGCTACAGAAGATAGTCTACACCTTCCCCA1446BamHⅠXhoⅠVP1VP1-FCCCCGGTACCATGAGTGACGTATTCAACAGTCVP1-RGGCCTCGAGCTATTGGCGGCTCTCCTTCTG2643KpnⅠXhoⅠ截短VP2(P-VP2)P-VP2FCGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCCP-VP2RCCCCGAATTCTGTAATTGTCACTCCACCTGCTTGG666BamHⅠEcoRⅠ截短VP1(P-VP1)P-VP1FCCCCGAATTCGAGATCCTTGCCGAACTGAACP-VP1RCCCGCTCGAGCTATTGGCGGCTCTCCTTCTG573EcoRⅠXhoⅠVP2-VP1P-VP2FCGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCCP-VP1RCCCGCTCGAGCTATTGGCGGCTCTCCTTCTG1239BamHⅠXhoⅠ

注：加粗斜體代表酶切位點(diǎn)

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 IBDV VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因的擴(kuò)增

提取IBDV NN1172分離株的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別擴(kuò)增VP1、VP2和P-VP2、P-VP1基因。用EcoRⅠ處理純化后的P-VP2、P-VP1片段，T4連接酶連接P-VP2和P-VP1基因。以連接產(chǎn)物為模板，P-VP2F/P-VP1R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物即為VP2-VP1串聯(lián)基因。擴(kuò)增IBDV VP2,VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因PCR反應(yīng)體系：Mix 12.5 μL，cDNA 1 μL，各基因所對(duì)應(yīng)的上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將目的片段VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因和表達(dá)載體pET-32a分別用BamHⅠ/XhoⅠ，KpnⅠ/EcoRⅠ和BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后回收，用T4連接酶進(jìn)行重組連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定正確后，將重組質(zhì)粒送華大基因有限公司測(cè)序。鑒定正確的菌株分別命名為pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1。

1.5 VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因的誘導(dǎo)表達(dá)

1.5.1 誘導(dǎo)表達(dá)及其條件的優(yōu)化

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1分別轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21，涂于氨芐抗性的LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑單個(gè)菌落接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12 h，制備種子菌，所得菌種按照1%的量接種到新的含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)至菌液OD595=0.6，取出加入1 mmol/L的IPTG,于37 ℃ 220 r/min的恒溫?fù)u床中誘導(dǎo)表達(dá)，分別在2、3、4、5、6和7 h各收集1 mL菌液，經(jīng)SDS-PAGE分析對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。然后以?xún)?yōu)化的最佳誘導(dǎo)時(shí)間，對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度進(jìn)行優(yōu)化，IPTG濃度分別為0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1 mmol/L(其中誘導(dǎo)IBDV VP1蛋白的IPTG濃度梯度為0.01、0.03、0.05、0.08、0.1、0.3、0.5 mmol/L)。同時(shí)，在含空載體pET-32a的培養(yǎng)菌液中也加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1 mmol/L作相同處理。

1.5.2 分析重組蛋白表達(dá)形式

離心收集菌體后加入PBS重懸菌體，并加入溶菌酶至終濃度1 mg/mL，冰上放置30 min。細(xì)菌懸液于-20 ℃反復(fù)凍融3次，用超聲破碎儀破碎菌體，破碎后的菌液經(jīng)4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 純化重組蛋白

根據(jù)優(yōu)化條件大量表達(dá)目的蛋白，4 ℃ 8 000 r/min離心30 min，棄上清，收獲菌體。通過(guò)蛋白的粗純化，具體方法如下：30 mL PBS重懸洗滌菌體，4 ℃，6 000 r/min 離心30 min，收集菌體；以10 mL/g菌體的比例加入PBS重懸菌體沉淀，加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，混勻后冰上放置30 min；于-80 ℃反復(fù)凍融3次，超聲破碎儀破碎菌體，結(jié)束后4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，棄上清；向包涵體沉淀中加入20 mL包涵體洗滌液(50 mmol/L Tris-Cl、50 mmol/L NaCl、2 mol/L Urea、0.5%曲拉通，pH 8.0)，漩渦振蕩懸浮包涵體沉淀，置冰上10 min后，經(jīng)4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，棄上清收集沉淀，重復(fù)2次；向沉淀中加入40 mL包涵體溶解液(100 mmol/L Na2HPO4、10 mmol/L Tris-Cl、8 mol/L Urea，pH 8.0)，重懸于50 mL的小燒杯，用磁力攪拌器于4 ℃攪拌3 h，使包涵體更加有效地溶解，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，收集上清。將粗純化后的重組蛋白溶液經(jīng)Ni-NTA親和層析介質(zhì)蛋白純化試劑盒純化(具體操作按說(shuō)明書(shū))。取Ni-NTA親和層析純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 表達(dá)蛋白的Western blot分析

取純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用TBST洗滌PVDF膜，然后轉(zhuǎn)入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后于4 ℃過(guò)夜封閉。用TBST洗滌3次，10 min/次，最后用TBS洗滌10 min。加入用TBST以1∶100稀釋的雞抗IBDV陽(yáng)性血清，室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次10 min。之后加入1∶7000稀釋的HRP山羊抗雞IgY二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，每次10 min，最后TBS洗10 min，用濾紙吸干PVDF膜上的水分，暗室DAB顯色，3 min后加入去離子水終止反應(yīng)。

1.8 表達(dá)蛋白的特異性及其臨床初步應(yīng)用

以純化的VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白作為包被抗原，分別檢測(cè)IBV、ReoV、ALV和NDV 4種陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，每種血清樣品重復(fù)3次，以探究其特異性。并且還檢測(cè)分別免疫了IBD滅活疫苗、IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商業(yè)雞群的570份免疫血清，其中免疫IBD滅活疫苗和IBD基因工程疫苗的雞群分別在免疫前和免疫后的第7、14、21、28、35、42天共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集30份(免疫IBD弱毒疫苗分別在一免前(9d)、二免前(16d)和二免后的第7、14、21天共5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn), 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集30份)，以觀察疫苗免疫后的抗體應(yīng)答水平。此外，用該間接ELISA以及商品試劑盒A、B平行檢測(cè)OD450在其臨界值附近的184份血清樣品，用來(lái)觀察其與商品試劑盒的相對(duì)敏感性及符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

瓊脂糖凝膠電泳顯示，成功擴(kuò)增出NN1172 VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因目的條帶，分別約為1 446、2 643和1 239 bp。將其克隆入原核表達(dá)載體pET-32a，經(jīng)雙酶切鑒定，證實(shí)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1，結(jié)果分別可見(jiàn)約1 446、2 643和1 239 bp相應(yīng)大小的外源基因和5 900 bp的線性化質(zhì)粒條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的VP2、VP1和VP2-VP1串聯(lián)基因片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，且無(wú)堿基的突變和插入。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1.pET-32a經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；2.pET-VP2經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；3.pET-32a經(jīng)KpnⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；4.pET-VP1經(jīng)KpnⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；5.pET-VP2-VP1經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；6.pET-32a經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物

圖1 pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果顯示，VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白均在IPTG誘導(dǎo)2 h時(shí)開(kāi)始表達(dá)，其中VP2在誘導(dǎo)5 h表達(dá)量最多，VP1在3 h后開(kāi)始維持穩(wěn)定表達(dá)，VP2-VP1在6 h表達(dá)量最多，之后無(wú)明顯差別(見(jiàn)圖2)。最佳誘導(dǎo)IPTG濃度優(yōu)化結(jié)果顯示，0.05～1 mmol/L不同誘導(dǎo)濃度對(duì)重組蛋白VP2、VP1和VP2-VP1的表達(dá)量沒(méi)有明顯的影響(見(jiàn)圖3)，為降低試驗(yàn)成本，后續(xù)試驗(yàn)選擇0.05 mmol/L的IPTG對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 表達(dá)蛋白的可溶性分析

將重組表達(dá)蛋白經(jīng)超聲破碎處理后，分別將獲得的上清和沉淀加熱變性，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中未見(jiàn)預(yù)期蛋白條帶，而沉淀中可見(jiàn)預(yù)期蛋白條帶，說(shuō)明表達(dá)的VP2，VP1和VP2-VP1蛋白均存在于細(xì)菌沉淀中，為非溶性蛋白，且主要以包涵體的形式表達(dá)(見(jiàn)圖4)。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1.pET-32a 無(wú)IPTG誘導(dǎo); 2.pET-32a 經(jīng)IPTG誘導(dǎo); 3.重組表達(dá)菌無(wú)IPTG誘導(dǎo); 4～9.重組表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2、3、4、5、6和7 h

圖2 pET-VP2(A)、pET-VP1(A)和pET-VP2-VP1(C)重組表達(dá)質(zhì)粒在BL21菌株中最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1.pET-32a 無(wú)IPTG誘導(dǎo); 2.pET-32a 經(jīng)IPTG誘導(dǎo); 3.重組表達(dá)菌無(wú)IPTG誘導(dǎo); 4～10.重組表達(dá)菌分別經(jīng)0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)

圖3 pET-VP2(A)、pET-VP1(B)和pET-VP2-VP1(C)重組表達(dá)質(zhì)粒在BL21菌株中最佳IPTG誘導(dǎo)濃度的確定

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.重組表達(dá)菌經(jīng)超聲破碎處理后的上清; 2.重組表達(dá)菌經(jīng)超聲破碎處理后的沉淀

圖4 VP2(A)、VP1(B)和VP2-VP1(C)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析

2.4 重組表達(dá)蛋白的純化

將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)蛋白的粗純化和Ni-NTA親和層析純化后，并以純化前的溶液作對(duì)照，SDS-PAGE分析顯示，純化所得的重組蛋白大小分別為69、114和63 kDa左右，無(wú)其他雜蛋白，純化效果良好(見(jiàn)圖5)。

2.5 表達(dá)蛋白Western blot鑒定結(jié)果

對(duì)各重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示，空載體pET-32a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液沒(méi)有反應(yīng)條帶，而VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白分別在69、114和63 kDa的位置與抗IBDV抗體有反應(yīng)條帶，且無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖6)，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物均可與雞抗IBDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物; 2.表達(dá)產(chǎn)物純化

圖5 VP2(A)、VP1(B)和VP2-VP1(C)表達(dá)產(chǎn)物的純化

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.pET-32a誘導(dǎo)蛋白與抗IBDV抗體作用; 2.重組表達(dá)蛋白純化后與抗IBDV抗體作用

圖6 VP2(A)、VP1(B)和VP2-VP1(C)表達(dá)蛋白的Western blot鑒定

2.6 表達(dá)蛋白的臨床初步應(yīng)用分析

以表達(dá)純化的VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白作為包被抗原，分別對(duì)IBV、ReoV、ALV和NDV 4種陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明所獲得的純化蛋白具有高度的特異性。并且還分別檢測(cè)免疫了IBD滅活疫苗, IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商業(yè)雞群的570份免疫血清，抗體檢測(cè)結(jié)果均能顯示疫苗免疫后機(jī)體抗體水平的變化趨勢(shì)(圖7)。

圖7 以純化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白為包被抗原來(lái)分別檢測(cè)免疫了IBD滅活疫苗, IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商業(yè)雞群的免疫血清情況

3 討論

IBD是由IBDV引起雛雞的一種急性，高度接觸性和免疫抑制性的病毒性疾病，尤其是近年來(lái)vvIBDV的出現(xiàn)給全球家禽產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。因此，對(duì)雞群IBDV的早期監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。而采用血清學(xué)方法監(jiān)測(cè)雞群IBD感染情況和雞群免疫后的抗體水平，有利于建立免疫檢測(cè)體系、進(jìn)行疫苗免疫效力評(píng)估和制定合理的免疫程序[12]。

目前，市場(chǎng)上雖已有檢測(cè)IBDV抗體的商品試劑盒，但均以全病毒作為包被抗原，純化全病毒費(fèi)時(shí)費(fèi)力且價(jià)格高昂，進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)有較強(qiáng)的背景反應(yīng)和非特異性反應(yīng)，而限制了其在基層的推廣應(yīng)用。此外，全病毒包被，可能因?yàn)椴煌局瓯砻婵乖牟町愂沟冒欢局昱c檢測(cè)毒株差異大的病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體沒(méi)有被全病毒抗原包被所完全檢測(cè)出來(lái)，導(dǎo)致檢測(cè)的抗體滴度偏低，不能準(zhǔn)確反映實(shí)際的可以應(yīng)答水平[16-17]。并且與全病毒為包被抗原相比，該方法具有成本低廉、生物安全性高的優(yōu)點(diǎn)，且不存在潛在病毒擴(kuò)散的威脅。課題組連續(xù)多年對(duì)IBDV分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示VP2并非是決定病毒毒力的唯一因素[18]，并認(rèn)為其毒力和抗原性與不同來(lái)源VP1片段的重排或重組有關(guān)[14-15]。本研究所表達(dá)純化的3個(gè)蛋白均具有較高的特異性，實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)臨床的570份血清樣品均能顯示疫苗免疫后正常的抗體水平及其變化的趨勢(shì)。并且與商品試劑盒A、B作平行檢測(cè)184份臨床血清樣品顯示，以VP2蛋白為包被抗原的相對(duì)敏感性和符合率是最高的。原因可能是，VP2上有中和性抗原表位、毒力相關(guān)性抗原表位，同時(shí)包括與誘導(dǎo)中和抗體有關(guān)的抗原決定簇。本文采用PCR擴(kuò)增基因串聯(lián)法[19-20]，首次成功表達(dá)VP2-VP1重組蛋白，并發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的VP2和VP1表達(dá)、VP2-VP1串聯(lián)表達(dá)均與IBDV野毒株血清發(fā)生良好的免疫反應(yīng)，表明表達(dá)的蛋白能與不同毒株來(lái)源的抗血清具有良好的免疫學(xué)反應(yīng)，研究結(jié)果為利用表達(dá)的VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白作為包被抗原，建立相關(guān)的抗體檢測(cè)方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

IBDV衣殼蛋白VP2是宿主重要的免疫保護(hù)性抗原，它與病毒毒力變異、抗原漂變和細(xì)胞凋亡等有關(guān)[21]。近年來(lái)，VP1蛋白被認(rèn)為也與病毒的復(fù)制和毒力有關(guān)[11]。目前，VP2蛋白已在重組病毒、酵母等表達(dá)系統(tǒng)中得到成功表達(dá)[22-23]。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比而言，原核表達(dá)系統(tǒng)因遺傳背景清晰、速度快、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)勢(shì)，成為外源基因表達(dá)最常用的表達(dá)系統(tǒng)[24]。而pET載體因具有蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)作為最常用的大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒。此外，本研究采用的pET-32a載體還含組氨酸標(biāo)簽和Trx標(biāo)簽，與目的蛋白融合后可方便蛋白的純化和促進(jìn)外源蛋白的可溶性表達(dá)。但在SDS-PAGE的可溶性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均以包涵體的形式表達(dá)，這與之前對(duì)VP2和VP1蛋白的研究結(jié)果相似，推測(cè)可能是重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)速率過(guò)快，蛋白的部分折疊或錯(cuò)誤折疊而造成的[25]。而高祥等[26]在冷休克條件下在Transetta(DE3)工程菌中實(shí)現(xiàn)衣殼蛋白VP2的可溶性表達(dá)。劉丹等[12]使用pET-32a載體表達(dá)IBDV衣殼蛋白VP2，誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)在BL21中不表達(dá)，但在Rosetta(DE3)中經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h時(shí)表達(dá)量明顯提高。而本研究利用pET-32a載體，通過(guò)不斷對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)VP2、VP1和VP2-VP1 3種重組蛋白均可在BL21菌株中以包涵體的形式大量表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)蛋白的表達(dá)量與各試驗(yàn)條件的優(yōu)化密切相關(guān)，本文通過(guò)對(duì)各試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，VP2、VP1和VP2-VP1重組蛋白在IPTG濃度為0.05 mmol/L誘導(dǎo)2 h開(kāi)始表達(dá)，其中分別在5 h、3 h和6 h時(shí)的蛋白表達(dá)量最多。并且發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化前應(yīng)先對(duì)蛋白粗純化，這樣可去除大部雜蛋白以獲得更高純度的目的蛋白。純化后的3種重組蛋白均可與雞抗IBDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性識(shí)別，表明純化后的重組蛋白均具有良好的免疫反應(yīng)活性，為下一步IBDV特異性抗體的檢測(cè)方法的建立和新型亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。