任建鸞，張鵬，殷晗杰，黃豪勝，楊德鴻，曾頏，李一昊

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物細(xì)菌學(xué)重點實驗室/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

仔豬黃白痢為仔豬黃痢和白痢的合稱，是一種常見的仔豬腸道傳染病，既增加養(yǎng)殖業(yè)的用藥費用，還會直接對仔豬的成活率產(chǎn)生影響，甚至使其無法正常生長發(fā)育，對現(xiàn)代規(guī)模化豬場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)是引起仔豬黃白痢的重要致病菌，常感染新生仔豬和斷奶仔豬，患病豬群表現(xiàn)為新生仔豬拉黃色痢疾，哺乳期仔豬拉黏稠的白色痢疾，嚴(yán)重病例會導(dǎo)致死亡；此外ETEC還會引起嬰幼兒的腹瀉，是一種十分嚴(yán)重的人畜共患病[2-3]。ETEC的毒力因子腸毒素(enterotoxin)是 ETEC 在體內(nèi)或者體外生長時產(chǎn)生并且分泌到細(xì)胞外的一類蛋白質(zhì)性質(zhì)的毒素，包括不耐熱腸毒素(heat labile enterotoxin,LT)和耐熱腸毒素(heat stable enterotoxin,ST)[4]。

畜類攜帶ETEC不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，且已成為威脅食品安全的重要風(fēng)險因素[5]。動物源性食品中污染的ETEC致病菌不僅嚴(yán)重危害人類健康，而且養(yǎng)殖場濫用藥物會導(dǎo)致耐藥性ETEC的大量產(chǎn)生和廣泛傳播，這些耐藥菌通過生產(chǎn)鏈最終污染產(chǎn)品，使得食源性細(xì)菌疾病的防控和治療更加困難[6]。因此對我國規(guī)?；i場ETEC的感染情況進(jìn)行調(diào)查具有非常重要的意義。本研究采集了安徽地區(qū)部分規(guī)模化豬場的仔豬黃白痢病料，進(jìn)行了ETEC菌株的分離鑒定，并對分離的ETEC菌株進(jìn)行了血清型、耐藥性及毒力的測定，為該地區(qū)規(guī)?；i場ETEC感染的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑及菌株

酵母提取物、胰蛋白胨、MHA(Mueller-Hinton Agar)培養(yǎng)基、MAC(MacConkey Agar)培養(yǎng)基購自英國Oxoid公司；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清購自天津生物芯片有限責(zé)任公司；抗生素藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；2×PCR Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；佐劑購自法國SEPPIC公司；PCR儀為日本TaKaRa公司制造；分光光度計及凝膠成像儀為美國Bio-Rad公司制造。參考陽性菌株為本實驗室保存的ST陽性菌株CVCC1521和LT陽性菌株CVCC1526

1.2 樣品的采集及處理

采集安徽全椒、肥東、肥西、埇橋、亳州和南陵6個不同地區(qū)17個規(guī)?；i場的仔豬黃白痢病料479份，主要采集2日齡仔豬及斷奶后仔豬的新鮮糞便、直腸棉拭子，將采集的樣品置于無菌離心管中，并放于冰盒中，于1周之內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行樣品的分離鑒定。用無菌接種環(huán)挑取樣品，在麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行劃線，隨后將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日在平板上挑取紅色菌落(疑似大腸桿菌菌落)，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR鑒定

為進(jìn)一步鑒定以上菌落是否為大腸桿菌，針對大腸桿菌16S rRNA的基因片段設(shè)計了特異性引物(表1)。LT和耐熱腸毒素ST是ETEC 的重要毒力因子，因此本研究根據(jù)LT和ST序列設(shè)計特異性引物(表1)，用于鑒定ETEC。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：Mix12.5 μL、上下游引物各1 μL、細(xì)菌模板2 μL和水8.5 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；最后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳，通過凝膠成像儀觀察條帶大小并分析結(jié)果。

表1 ETEC特異性鑒定引物

引物名稱引物序列(5′-3′)產(chǎn)物大小/bpST-1AGGCCCGCATCCAGTTAT85ST-2CGAGTGACGGCTTTGTAGLT-1ACGGCGTTACTATCCTCT280LT-2CAATTTTGGTCTCGGTCA16SrRNA-1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG138116SrRNA-2GGTTACCTTGTTACGACTT

1.4 血清凝集試驗

選用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O抗原血清對分離菌株進(jìn)行血清凝集試驗。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)說明，待檢菌株與標(biāo)準(zhǔn)血清混合后經(jīng)肉眼觀察出現(xiàn)“++”及以上凝集現(xiàn)象即為該種標(biāo)準(zhǔn)血清的血清型。將上述鑒定出的ETEC菌株與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行玻片凝集試驗，若出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，即定型待檢菌株的血清型；經(jīng)過玻片凝集試驗后未發(fā)生凝集現(xiàn)象時，則選擇ETEC相應(yīng)多價血清進(jìn)行驗證，若出現(xiàn)陽性凝集現(xiàn)象，再選擇多價血清中包含的單價血清鑒定，最終確定ETEC菌株的血清型。

血清凝集試驗前，首先要將ETEC菌株劃線LB平板，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，取出平板后，用1 mL 0.9%生理鹽水洗菌，待洗到濃度最大時裝于管中煮沸30 min，以此來破壞K、H抗原的干擾，作為待檢菌株。取潔凈玻片，吸取菌液滴于玻片兩端，一滴加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)血清，一滴加入生理鹽水，輕輕晃動玻片，傾斜玻片于1 min內(nèi)觀察試驗現(xiàn)象，以出現(xiàn)“++”及以上凝集反應(yīng)判定陽性結(jié)果。

1.5 藥敏試驗

根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)對本研究中鑒定的ETEC菌株進(jìn)行藥敏試驗[7]。共選用13種藥敏片進(jìn)行檢測，包括青霉素類阿莫西林、頭孢類頭孢噻肟、多肽類多黏菌素B、四環(huán)素類強(qiáng)力霉素和四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類紅霉素、氨基糖苷類慶大霉素和丁胺卡那、氯霉素類氯霉素、喹諾酮類恩諾沙星和環(huán)丙沙星及磺胺類藥物甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。據(jù)CLSI公布的大腸桿菌對抗生素藥敏紙片敏感范圍的最新標(biāo)準(zhǔn)(表2)，將藥敏試驗結(jié)果分為耐藥(R)、中介(I)和敏感(S)。

表2 藥敏紙片抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)

抗生素每片含量/μg抑菌圈直徑/mmRIS抗生素每片含量/μg抑菌圈直徑/mmRIS新霉素30≤1718～22≥23強(qiáng)力霉素30≤1819～22≥23氟苯尼考30≤1415～16≥17阿莫西林10≤1314～17≥18丁胺卡那30≤1415～16≥17STX25≤1011～15≥16慶大霉素10≤1213～14≥15四環(huán)素30≤1415～18≥19恩諾沙星5≤1213～15≥16環(huán)丙沙星5≤1516～20≥21多黏菌素B30≤89～11≥12紅霉素15≤1314～22≥23頭孢噻肟30≤1617～25≥26氯霉素30≤1213～17≥18

1.6 優(yōu)勢血清型菌株的毒力測定

將本研究中鑒定的優(yōu)勢血清型菌株濃度調(diào)整為2.5×107cfu/mL，對4周齡ICR雌性小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，每只0.2 mL，每株菌攻毒6只小鼠，同時設(shè)陰性對照。于7 d內(nèi)記錄小鼠的死亡情況。根據(jù)小鼠死亡數(shù)量判定ETEC菌株的致病力，將死亡5～6只小鼠的菌株判定為強(qiáng)毒株，死亡2～4只判定為中等毒力菌株，死亡0～1只判定為弱毒株。

2 結(jié)果

2.1 ETEC的分離鑒定

對待檢菌株進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增，若菌株在1 381 bp處出現(xiàn)條帶，則送公司測序，并NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，與大腸桿菌同源性為98%以上的，鑒定為大腸桿菌。所得大腸桿菌再進(jìn)行LT和ST的PCR鑒定，結(jié)果顯示479份樣品中鑒定為ETEC的菌株有110株，且各個地區(qū)均有分布。其中：同時含有ST和LT基因的菌株6株，占5.5%；僅含有ST基因的菌株97株，占88.2%；僅含有LT基因的菌株7株，占6.4%。

2.2 血清型鑒定

對ETEC菌株進(jìn)行血清凝集試驗，結(jié)果110株ETEC中52株可定型，占ETEC菌株總數(shù)的47.3%，8株出現(xiàn)自凝反應(yīng)，其余未能定型。共鑒定出O8、O20、O128、O15、O25、O114、O169、O159、O3、O9、O149、O137和O141共13種血清型，以O(shè)8、O20、O128為該地區(qū)的優(yōu)勢血清型，其中：O8血清型占定型菌株的26.9%(14/52)，O20血清型占定型菌株的21.2%(11/52)，O128血清型占定型菌株的11.5%(6/52)。ETEC定型的菌株中有59.6%是優(yōu)勢血清型，占分離菌株的28.2%。此外還分離到O15血清型5株，占9.6%；O25血清型4株，占7.7%；O114、O169、O159和O3血清型各2株，分別占3.8%；O9、O149、O137和O141各1株，分別占1.9%。

2.3 ETEC菌株耐藥性分析

藥敏試驗結(jié)果表明，分離的110株ETEC菌株對丁胺卡那、恩諾沙星、頭孢噻肟等抗生素的敏感率分別為60%、57.3%和60%，其中對多黏菌素B的敏感率達(dá)到90%以上(表3)。安徽地區(qū)分離到的110株ETEC菌株表現(xiàn)出高耐藥性，對強(qiáng)力霉素的耐藥率高達(dá)100%(110/110)；對新霉素、紅霉素、慶大霉素、阿莫西林、四環(huán)素等抗生素的耐藥率分別為77.3%(85/110)、94.5%(104/110)、77.3%(85/110)、91.8%(101/110)、97.3%(107/110)，耐藥率均高達(dá)75%以上。安徽地區(qū)分離的110株ETEC對多種抗生素均有耐藥性，用13種藥敏片對ETEC菌株進(jìn)行試驗，其中9、10重耐藥菌株數(shù)最多，分別占比19.1%；10重耐藥以上的ETEC菌株有42株，耐藥率達(dá)38.1%，以安徽中部偏南區(qū)域為主。

表3 110株ETEC菌株藥敏試驗結(jié)果

抗生素菌株數(shù)(占比)RIS新霉素85(77.3%)25(22.7%)0丁胺卡那44(40%)15(13.6%)51(46.4%)紅霉素104(94.5%)6(5.5%)0慶大霉素85(77.3%)1(0.9%)24(21.8%)恩諾沙星47(42.7%)11(10%)52(47.3%)環(huán)丙沙星49(44.5%)14(12.7%)47(42.7%)多黏菌素B011(10%)99(90%)頭孢噻肟44(40%)9(8.2%)57(51.8%)強(qiáng)力霉素110(100%)00阿莫西林101(91.8%)09(8.2%)甲氧芐啶/磺胺甲惡唑104(94.5%)06(5.5%)四環(huán)素107(97.3%)1(0.9%)2(1.8%)氯霉素79(71.8%)3(2.7%)28(25.5%)

2.4 ETEC優(yōu)勢血清型菌株毒力測定

分別將優(yōu)勢血清型O8、O20、O128菌株以5×107cfu/只的攻毒劑量對4周齡ICR小鼠攻毒，每只小鼠腹腔注射0.2 mL，每組6只。毒力測定結(jié)果選擇3次試驗的平均數(shù)，試驗表明，14株O8血清型有7株強(qiáng)毒株，占比50%(7/14)；6株菌為中等毒力菌株，1株為弱毒株(表4)。O20血清型強(qiáng)毒株占比72.7%(8/11)(表5)；O128血清型強(qiáng)毒株占比66.7%(4/6)(表6)。

表4 O8血清型ETEC小鼠致病力

攻毒菌株來源死亡情況攻毒菌株來源死亡情況FXYD4-1肥西6/6QJDS1全椒4/6YQBYZ2-1埇橋6/6NLGS2-3南陵4/6QJXW2-1全椒6/6YQBYZK2-1埇橋3/6QJSS2-1全椒6/6NLGS1南陵2/6QJSS3-1全椒6/6QJZX3全椒2/6NLGS2-1南陵6/6QJZX2全椒2/6NLGS2-2南陵6/6BZGL1-1亳州1/6PBS0/6

表5 O20血清型ETEC小鼠致病力

攻毒菌株來源死亡情況攻毒菌株來源死亡情況QJSS2-2全椒6/6QJSS2-3全椒6/6FDDS1肥東6/6QJSS2-4全椒4/6QJDS2全椒6/6QJSS2-5全椒4/6FXGZ2肥西6/6FXYQ1肥西3/6FXYD4-2肥西6/6PBS0/6BZGL1-2亳州6/6QJSS3-2全椒6/6

表6 O128血清型ETEC小鼠致病力

攻毒菌株來源死亡情況YQBYZ1埇橋6/6YQBYZ2-2埇橋6/6YQBYZK2-2埇橋6/6QJXW2-2全椒6/6YQBYZ2-4全椒4/6YQBYZ2-3全椒0/6PBS0/6

3 討論

仔豬黃白痢是規(guī)?；i場難以根除的動物傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的挑戰(zhàn)[8-9]。本試驗對安徽規(guī)?；i場仔豬黃白痢樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，從479份樣品中分離出110株ETEC菌株，表明ETEC在仔豬黃白痢樣品中分離率較高，也進(jìn)一步證實該菌為造成仔豬黃白痢的主要病原之一。

大腸桿菌血清型達(dá)180多種，且在實際操作過程中存在不凝和自凝等無法判定血清型的現(xiàn)象。本研究共鑒定出52株ETEC分離株的血清型，定型率達(dá)菌株總數(shù)的47.3%，其中以O(shè)8、O20、O128三種血清型為安徽地區(qū)的優(yōu)勢血清型，占定型菌株的59.6%，且分布比較廣泛。據(jù)報道，豬源ETEC常見血清型有O8、O11、O128、O9、O138、O101和O149等[10]，本試驗與前人報道相符。本實驗室還在2017—2018年對蘇北部分地區(qū)21個規(guī)?；i場的仔豬黃白痢樣品進(jìn)行了ETEC菌株的分離鑒定，結(jié)果表明蘇北地區(qū)ETEC的優(yōu)勢血清型主要為O8、O101和O128[11]，與本研究中的優(yōu)勢血清型有部分重合，且都在前人報道的常見血清中，表明我國不同地區(qū)ETEC的優(yōu)勢血清型主要集中于幾個常見的血清型，這對ETEC的防控具有重要的指導(dǎo)意義。

由于抗生素的廣泛使用，菌株的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)峻，已引起了全世界的廣泛關(guān)注。本研究對110株分離菌株的耐藥性做了調(diào)查，耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，在13種測試藥物中，對6種藥物的耐藥率均高于70%，對強(qiáng)力霉素的耐藥率甚至高達(dá)100%，且大部分菌株呈現(xiàn)多重耐藥，其中9、10重耐藥菌株數(shù)占比高達(dá)19.1%。而在其他ETEC相關(guān)報道中，耐藥現(xiàn)象也非常嚴(yán)峻[12-14]，提示我們要盡快制定應(yīng)對策略，減少抗生素的濫用，同時積極尋找抗生素替代療法，如噬菌體、抗菌肽等[15-16]。

為驗證本研究中分離的ETEC菌株是否是造成仔豬黃白痢的關(guān)鍵病原菌，利用小鼠作為動物模型，對110株ETEC分離株中3個優(yōu)勢血清型的所有菌株(O8血清型14株，O20血清型11株，O128血清型6株)進(jìn)行了毒力測定，結(jié)果表明O8、O20和O128中高毒力菌株占各自血清型菌株的比例分別為50%(7/14)、72.7%(8/11)和66.7%((4/6)，表明優(yōu)勢血清型菌株的毒力普遍較高，提示它們是造成規(guī)?；i場仔豬黃白痢的關(guān)鍵病原。因此，豬場可考慮針對這些優(yōu)勢血清型菌株制備滅活疫苗，用于豬場仔豬黃白痢的防控。