陳雨晴，曹潔，王玉峰，宋素泉，閆麗萍

(教育部動物健康與食品安全國際聯(lián)合試驗室/江蘇省動物免疫工程試驗室/江蘇省陸生野生動物疫源疫病檢測中心/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫研究所/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬成員，是呈二十面體對稱的無囊膜雙股DNA病毒[1-2]。它由核蛋白、衣殼蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。其中Hexon是病毒表面含量最多的蛋白，常用于做禽腺病毒的進化分析[3]。根據(jù)血清交叉中和試驗和基因組分析顯示禽腺病毒可分為A～E 5個種，12個血清型(1～7、8a、8b、9～11)。其中，血清1型(fowl adenovirus serotype 1，F(xiàn)AdV-1)和血清4型(fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)主要引起禽類的肌胃糜爛或潰瘍和心包積液肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)。而血清2、7、8a、8b、11型則在世界范圍內(nèi)引起包涵體肝炎(inclusion body hepatitis, IBH)[4]。HHS在雞群中的感染率很高，其中肉雞的死亡率在10%～100%之間[5]。該病一般發(fā)生于3～5周齡肉雞中，其癥狀主要表現(xiàn)為心臟表面被黃色透明液體包裹，心臟畸形且變軟，心包黃染伴有出血點。一般患有心包積液的病雞其肝臟也伴有病變，如肝臟腫大充血、腎臟腫大出血等[6]。

禽腺病毒主要感染蛋雞、肉雞、鵝和鴕鳥。2007年之前，IBH在我國多呈散發(fā)，并未造成嚴(yán)重損失；2007至2014年，IBH呈地方性流行，個別雞場發(fā)病率可達30%，死亡率15%；從2015年開始，F(xiàn)AdV-4在我國大范圍流行并引起了IBH和HHS，造成雞群大量死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[7]。經(jīng)流行病學(xué)分析顯示FAdV-4主要在我國北部和東部流行[8]。由于有一些弱毒感染雞群后不導(dǎo)致雞群發(fā)病，而水禽又是FAdV的天然儲存庫，這些因素可能是導(dǎo)致FAdV-4大流行的原因[1]。2015年以來已有一些文獻報道了高毒力禽腺病毒，但其研究大多在流行病學(xué)調(diào)查、進化分析以及治療上[9-10]，少有文章對病毒的致病力進行研究。本研究從江蘇省某發(fā)病雞場分離獲得1株禽腺病毒，并將其分離后進行致病性試驗，為進一步預(yù)防和治療該病提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及試驗動物

取病雞肝臟0.1 g用無菌PBS進行研磨，制備成肝臟組織勻漿后-20 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min 離心10 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?。將上清?∶1 000感染雞肝癌細胞(LMH)，48 h后80%細胞變圓脫落，收集上清凍于-80 ℃。21日齡SPF雞由廣西麗原生物有限公司提供。

1.2 主要試劑

DMEM粉末購自Gibco公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase和HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit購自Vazyme公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自KPL公司；引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng)與病毒分離

LMH用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。將處理好的病料接種于長滿單層的LMH細胞，在37 ℃吸附1 h后棄上清，加入細胞維持液(DMEM+ 2%FBS)，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變(CPE)，連續(xù)在LMH細胞上傳代3次后，將病毒進行擴大培養(yǎng)并進行致病性試驗。

1.4 病毒DNA的提取

將病毒按1∶1 000接種LMH細胞，待80%左右細胞出現(xiàn)病變后，將細胞凍融2次后分裝于保種管中，按上海生工柱式病毒DNA提取試劑盒說明提取DNA，于-40 ℃保存。

1.5 FAdV-4 Hexon基因的PCR和序列測定

以GenBank中的FAdV-4全基因組序列(GenBank登錄號KU558760)為參考，使用Primer Premier 5軟件，設(shè)計覆蓋Hexon基因的引物(Hexon-F：5′-ATGGCGGCCCTCACGCCCG-3′；Hexon-R：5′-TTACACGGCGTTGCCTGTGGCGAAA-3′)，擴增片段大小為2 814 bp。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。以提取的病毒DNA為模板，加入合成的引物，按照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase說明書配置50 μL PCR體系進行Hexon結(jié)構(gòu)蛋白基因DNA的擴增。PCR結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠鑒定，切下目的條帶，按照AXYGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作說明進行DNA的回收。將回收的基因片段送上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.6 FAdV-4 Hexon基因序列進化樹分析

利用MEGA 7.0軟件將分離株的Hexon基因核酸序列與GenBank收錄的不同時期和地點的禽腺病毒的核酸序列進行遺傳演化分析。具體參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株信息

毒株血清型基因型GenBank登錄號年份國家ON1C4GU188428.12011加拿大JSJ13C4KM096544.12013中國HB1510C4KU587519.12016中國HNJZC4KU5587602015中國SCnj1601C4KY927938.12018中國SDJN0105C4MN1024132019中國SCcz1501C4KY9279362017中國HNSQC4KX640910.12016中國PK-01C4EU931693.12008印度KR5C4HE608152.12012澳大利亞U26221.1C10U26221.12000美國K181/10A1JN181575.12012韓國CELOA1U46933.11996澳大利亞340B5KC493646.12013澳大利亞X11D11AF339920.12001比利時764D9AF508958.22004比利時685D2AF508947.12004比利時CR119E6AF508954.22016比利時

1.7 病毒滴度的測定

LMH細胞傳至96孔板細胞單層80%～90%，將病毒液稀釋至10-2～10-10，每一稀釋度接種8孔，每孔100 μL，對照組加100 μL細胞營養(yǎng)液，37 ℃孵育1 h后換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，觀察3～5 d，記錄細胞病變情況，按Reed-Muench法計算TCID50。

1.8 病毒的生長動力學(xué)測定

按MOI=0.01的病毒量接種長滿單層LMH細胞的12孔板，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h 后換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，分別在接種病毒后的不同時間點(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h)收取細胞上清，37 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min 離心15 min，收取上清液，測定每個時間點收取上清的TCID50，共重復(fù)3次。

1.9 病毒對雞的致病性試驗

選用純化后第4代毒株測定分離株對21日齡SPF雞的致病力，測定時分別各選取SPF雞30只，隨機分成3組(表2)，每組10只，采取肌肉注射或口服方法分別用含有106.0個TCID50的病毒液進行攻毒。觀察14 d，記錄臨床癥狀和鼻、咽拭子排毒情況。采集的鼻拭子放入1 mL PBS中，凍融一次后，充分振蕩，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液提取DNA，進行qPCR檢測是否排毒，引物5′-AGTGTGTATGTGCGTTGGGTAG-3和 5′-CATTGTCATAACGATGGTGTAG-3′[11]。

表2 FAdV-4 動物試驗分組

組別毒種毒量接種方式ⅠPBS-肌注5只,口服5只ⅡF4200μL 106.0TCID50肌注ⅢF4200μL 106.0TCID50口服

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與純化

肝組織樣品處理液接種于長滿單層的LMH細胞36 h后就能觀察到細胞病變，病變細胞初期呈網(wǎng)格狀，病變范圍逐漸擴大，細胞出現(xiàn)融合，有明顯的合胞體，最后變圓脫落，待病變穩(wěn)定后獲得一株純化的病毒，命名為JS株。

2.2 病毒Hexon基因序列分析

以提取的分離株病毒DNA為模板，用合成的引物分別擴增出2 814 bp大小的特異性條帶，測序結(jié)果表明是FAdV-4 Hexon基因序列，與GenBank收錄的不同時期和不同地點分離的FAdV-4 Hexon的基因進化樹分析(圖1)，結(jié)果顯示：毒株FAdV-4 JS與我國主要流行的Ⅰ群禽腺病毒C基因型毒株(CH/HNJZ/2015、JSJ13、SDJN0105、HNSQ、HB15101、SCnj1601等)以及印度株P(guān)K-01的同源性最高，在同一分支上；與加拿大分離株ON1以及澳大利亞分離株KR5共屬于一個大的分支，同源性為96%。表明JS株為我國FAdV-4國內(nèi)流行株。

圖1 FAdV-4 Hexon基因進化樹分析

2.3 病毒的生長動力學(xué)

FAdV-4 JS株在LMH細胞上生長良好，以0.01 MOI接種病毒72 h后病毒滴度為107.0TCID50/0.1 mL，最高達到108.0TCID50/0.1 mL(圖2)。

2.4 對雞的致病性

第Ⅱ組雞從攻毒后第2天開始有發(fā)病死亡，其中死亡2只，其他7只雞均有不同程度的精神萎靡，沉郁等癥狀；攻毒后第3天又死亡7只，另1只有精神輕度沉郁，且隨時間推移，該雞恢復(fù)正常，死亡率為90%。第Ⅰ組和Ⅲ組雞沒有出現(xiàn)任何癥狀，死亡率為0。對其進行打分并繪制折線圖，其中精神，無癥狀0分，輕度沉郁1分，非常沉郁2分，極度虛脫3分，死亡4分，結(jié)果見圖3。

解剖病死雞，發(fā)現(xiàn)第Ⅱ組雞均有不同程度的心包積液，肝臟黃染肥大，腎腫大且有點狀出血，脾臟出血腫大等明顯癥狀。剖檢第Ⅲ組雞，發(fā)現(xiàn)其肝臟黃染，但其他部位未見明顯病變。

試驗結(jié)束后每組隨機挑選3只剖殺，對其心、肝、脾、肺、腎以及氣管、法氏囊進行熒光定量試驗，結(jié)果顯示：病毒主要靶器官為肝臟，且肌肉注射比口服感染效果更嚴(yán)重，口服感染組的病毒RNA載量基本在檢測線(100拷貝數(shù)/mg)附近(圖4)。

在攻毒后第1、3、5、7、9、11、13天采集咽肛拭子，進行熒光定量檢測其排毒情況，結(jié)果顯示攻毒后第Ⅱ組與第Ⅲ組雞的咽肛拭子均有排毒，其中第Ⅱ組雞的排毒情況在攻毒后第3～5天到達排毒高峰期，隨后降低(表3)。

圖2 JS株在LMH細胞上的生長曲線

圖3 SPF雞存活率(上)及狀態(tài)評分分析(下)

注：拷貝數(shù)低于100拷貝數(shù)/mg為陰性

圖4 病毒的組織分布情況

表3 攻毒后咽肛拭子排毒情況

組別第1天第3天第5天第7天第9天第11天第13天咽肛咽肛咽肛咽肛咽肛咽肛咽肛Ⅰ--------------Ⅱ+++++//////////Ⅲ+++++++++±±±-----

注：“/”表示第Ⅱ組僅剩1只雞，數(shù)據(jù)不具有代表性?！?+”表示強陽性，熒光定量計算的拷貝數(shù)大于1 000拷貝數(shù)/mg；“+”表示弱陽性，熒光定量計算的拷貝數(shù)在100～1 000拷貝數(shù)/mg；“±”表示弱陽性，熒光定量計算的拷貝數(shù)在100～150拷貝數(shù)/mg；“-”表示陰性，熒光定量計算的拷貝數(shù)小于100 拷貝數(shù)/mg

3 討論

2013年以來我國出現(xiàn)FAdV-4感染的疾病報告，且在2015年暴發(fā)心包積液肝炎綜合征。本研究室2017年從江蘇省某發(fā)病雞場分離獲得1株4型禽腺病毒，命名為JS株。經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)其與我國近期流行株相似。同時，通過測定了病毒的生長曲線，發(fā)現(xiàn)它可以很好地在LMH細胞上繁殖，病毒滴度高達108.0TCID50/100 μL，但從河南省感染的病禽肝臟組織中分離的HNJZ株在LMH上的毒價僅為106.5TCID50/100 μL[11]、SD0828在雞胚成纖維細胞上的毒價為105.3TCID50/100 μL[12]、SD1511在雞胚腎細胞上的毒價為103.2TCID50/100 μL[13]以及SDJN0105株在雞胚上的毒價為105.0TCID50/100 μL[3]，這些毒株均沒有本次分離的JS株毒價高。本試驗分離到1株在LMH細胞上生長良好的病毒株，有助于后續(xù)進行滅活疫苗的研究。將F4代病毒通過肌肉注射或口服感染的途徑對21日齡SPF雞進行攻毒，發(fā)現(xiàn)口服感染組的雞群并沒有產(chǎn)生精神沉郁或死亡癥狀，解剖后觀察到雞的肝臟黃染，并無其他變化；而肌注組的SPF雞在攻毒后24 h已出現(xiàn)輕度沉郁的癥狀，并在攻毒后3～5 d達到死亡高峰，引起了90%的死亡率。剖檢可看到很明顯的心包積液癥狀。這與已報道的CH/HNJZ/2015株的致病力有所不同[11]。盡管JS株與CH/HNJZ/2015株在Hexon基因水平上同源性達99%，但口服感染后呈現(xiàn)出不同的致病力，其中CH/HNJZ/2015株口服感染0.2 mL 105.0TCID50的病毒后，在攻毒后第5天達到100%死亡，而JS株在口服感染0.2 mL 106.0TCID50的病毒后，雞群沒有死亡也沒有明顯的臨床癥狀。剖檢后可看到肝臟黃染，無心包積液。2株病毒在Hexon基因水平上同源性高卻有不同的致病力，可以考慮可能是其他基因水平上的差別導(dǎo)致了兩株病毒毒力的不同。

已有研究通過不同感染方式調(diào)查FAdV-4對雞的致病力，發(fā)現(xiàn)口服感染致病力低于肌肉感染，這可能是由于口服感染時消化道對病毒具有一定的消化作用，影響了病毒的活性及在機體內(nèi)的吸附作用[6,13]。本試驗在2種感染方式的雞的咽拭子中都檢測到了排毒，這也證實了該病毒可能經(jīng)空氣-消化道傳播[13]。

對腺病毒在雞體內(nèi)的分布情況也進行了研究，發(fā)現(xiàn)肝臟中的病毒含量最高，且各組織臟器中病毒均有分布，這與其他研究結(jié)果一致，這也解釋了為何FAdV-4可在LMH細胞上更好繁殖。口服感染組雞沒有死亡但咽拭子也有排毒情況，說明不同的感染方式對雞的致病力不同，這一點與已有文獻報道相同[14]。本研究分離獲得了1株在LMH細胞上具有較高病毒滴度和高致病力的FAdV-4，為后續(xù)研究JS株的致病機理及制備針對FAdV-4的滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。