邢增楊，李金明，張細權，惠春暉，林哲敏，顧麗紅*

(1.海南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，海南 ?？?571100；2.文昌龍泉文昌雞實業(yè)有限公司，海南 文昌 571348；3.華南農業(yè)大學，廣東 廣州 510642)

雌雄鑒別技術是對家禽初生雛雌雄辨認的一種技術，廣泛應用于現(xiàn)代化大規(guī)模家禽養(yǎng)殖中[1]。該技術能夠給家禽養(yǎng)殖場提供單性別的種雛雞，以達到減少養(yǎng)殖空間和飼料成本的目的，進而增加經(jīng)濟效益[2]。翻肛鑒定和快慢羽自別雌雄是目前2種常用的雞雌雄鑒別技術[3]。翻肛鑒定是鑒定出殼后祖代雛雞的常用方法，利用不同性別家禽泄殖腔形態(tài)差異進行鑒定，但該方法只有經(jīng)過專業(yè)訓練的技術人員才能成功地運用，且容易受鑒別員個人因素的影響[2]。目前，對雞性別的鑒別運用較廣泛的分子技術主要有金銀羽雌雄鑒別[4]和快慢羽自別雌雄技術[5]，其中：前者根據(jù)控制雞羽色的金、銀色基因的伴性遺傳原理，通過雛雞出殼時的羽毛顏色(金銀羽)進行鑒別；后者則利用位于雞性染色體上K基因的伴性交叉遺傳現(xiàn)象，通過翅尖羽毛表型差異(快慢羽)鑒定雛雞的性別。本文主要是通過國內學者外對快慢羽基因遺傳和結構的分析進行總結歸納，闡述分子鑒定自別雌雄方法的優(yōu)勢。

1 快慢羽自別雌雄系的建立

雞的快慢羽常被用于初生雛雞的自別雌雄,簡便易行且快速準確,已被國內外家禽業(yè)廣泛應用。楊山等[6]從1971年起就快慢羽的遺傳方式、品系選育、自別雌雄雜種雞的羽型、生產(chǎn)性能和配合力等進行了研究。隨后，盧桂強等[7]研究廣源雞(1988年)、謝璞等[8]研究武定雞(1996年)、宋素芳等[1]研究固始雞(2003年)、穆阿麗等[9]研究瑯琊雞(2012年)、王海洲等[10]研究日照麻雞(2016年)、崔慎坤等[5]研究壽光雞(2016年)和紀守學等[11]研究大骨雞(2018年)時，先后建立了快慢羽自別雌雄純系(配套系)，并示范、應用和推廣。但普遍存在的問題是需要進行測交鑒定慢羽公雞的純雜性，耗時費力，因此急需一種方法能夠簡捷準確地進行快慢羽自別。

1.1 快慢羽表型分析

國內外科學家通過深入挖掘快慢羽性狀形成的機理，發(fā)現(xiàn)該性狀為伴性遺傳。伴性遺傳(sex-linked inheritance)又稱性連鎖，是指在遺傳過程中的子代部分性狀由性染色體上的基因控制，和性別有關。公雞和母雞各有一對性染色體，公雞的性染色體組成為ZZ，母雞的性染色體組成為ZW，Z、W為同源染色體。雛雞翅膀上的羽毛有主翼羽和覆主翼羽，根據(jù)主翼羽和覆主翼羽的長短分為雞分為快羽型和慢羽型。控制快慢羽這一表型的基因位點K性連鎖，且位于性染色體Z上，其等位基因K為顯性和k為隱性[12]。實踐證明，當公雞和母雞的基因型分別為ZkZk和ZkW時，表型為快羽型；當公雞的基因型為ZKZk或ZKZK，母雞的基因型為ZKW時，表型為慢羽型，所以快羽為隱性，慢羽為顯性。羽型分類參照楊山等[6]劃分快慢羽的方法。具體的對應關系見表1。

表1 快慢羽表型特征與基因型

表型顯隱性表型特征基因型母雞公雞快羽型隱性遺傳主翼羽長于覆主翼羽ZkWZkZk慢羽型顯性遺傳主翼羽與覆主翼羽等長ZKWZKZk;ZKZK慢羽型顯性遺傳主翼羽短于覆主翼羽ZKWZKZk;ZKZK慢羽型顯性遺傳無主翼羽,僅有覆主翼羽ZKWZKZk;ZKZK慢羽型顯性遺傳主翼羽與覆主翼羽均未長出ZKWZKZk;ZKZK

根據(jù)孟德爾遺傳定律和伴性遺傳原理，要使雜交后代中公雞的表型為慢羽型，母雞的表型為快羽型，需要其父母代公雞的基因型為ZkZk，母雞的基因型為ZKW。根據(jù)快慢羽伴性遺傳規(guī)律，快羽為隱性，其表現(xiàn)型與基因型一致；慢羽母雞性染色體為異型染色體，在Z染色體上只含有1個K基因，屬顯性遺傳，表現(xiàn)型與基因型也一致；慢羽公雞的性染色體為異型染色體，在2條Z染色體上各有1個K(或k)基因，對于基因型是ZKZk或ZKZK的公雞，其表型均屬慢羽，因此必須從慢羽公雞中找出基因型為ZKZK的純合慢羽公雞，淘汰基因型為ZKZk的雜合慢羽公雞，傳統(tǒng)的采用的方法是測交，即用快羽母雞或慢羽母雞測交慢羽公雞，淘汰子代中出現(xiàn)非慢羽雞的雜合慢羽公雞。所以以減少工作量、節(jié)約人力物力為目的進而探究K(或k)基因為當下研究的熱點。

1.2 快慢羽基因結構分析

慢羽基因位點K具有復雜的分子結構(圖1)[12]，與快慢羽表達關聯(lián)的DNA區(qū)域包括催乳素受體基因(PRLR)和精子鞭毛編碼蛋白2(SPEF2)基因(Warren，1925年)。快羽型個體僅含有PRLR和SPEF2基因，慢羽個體除了正常的PRLR和SPEF2基因外，還有PRLR和SPEF2不完全、不規(guī)則的復制片段。在復制區(qū)域，PRLR部分片段(dPRLR)和SPEF2部分片段(dSPEF2)連接在一起，連接點叫做斷點連接點(JS)。慢羽型個體在K基因位點具有內源病毒基因ev21[13-14]，其所在的區(qū)域被成為控制區(qū)域(OR)[15-16]，相應位置沒有ev21的區(qū)域叫做非控制區(qū)域(UR)。慢羽個體的K基因位點擁有OR和UR，快羽個體K基因位點只有UR。

圖1 假設K基因在Z染色體上的標準結構[12]

1.3 國內外快慢羽基因分子結構研究

自慢羽型和ev21基因的關聯(lián)被發(fā)現(xiàn)以來，ev21就被用作檢測快慢羽的分子標記[17-21]。Levin 等[17]發(fā)現(xiàn)ev21包含禽白血病病毒的全部基因序列，而該基因甚至直接影響慢羽的表達。Wimmers等[22]報道部分慢羽個體擁有ev21結構變體，在結構變體內ev21的大部分序列丟失。少數(shù)慢羽雞種不存在ev21基因插入，同時慢羽K基因也包含由SPEF2基因和PRLR基因的非編碼區(qū)融合組成的重復片段(dSPEF2/dPRLR基因)，該融合基因也是慢羽形成的重要候選基因之一。

Ev21基因可能造成快慢羽雞對禽白血病病毒(avian leukemia virus,ALV)的感染免疫效應存在差異性[23]，Boulliou等[24]和Tixier-Boichard等[25]研究發(fā)現(xiàn)快羽型個體也存在ev21基因。Bu等[26]和Zhao等[27]在快羽型個體檢測到PRLR和SPEF2基因復制片段融合體(dPRLR/dSPEF2)。Takenouchi等[12]對52個雞品種的1 994個個體進行ev21基因和dPRLR/dSPEF2復制片段檢測，結果發(fā)現(xiàn)只有1個品種的慢羽型只有融合基因dPRLR/dSPEF2，沒有ev21，除白普利茅斯雞外，24個品種的快羽型雞都即沒有ev21基因又沒有dPRLR/dSPEF2。

趙計昌[28]采用鏈特異性RT-PCR、熒光定量PCR等試驗對PRLR,SPEF2和dPRLR/dSPEF2基因是否都是雞快慢羽性狀控制基因的候選者進行了甄別，結果顯示PRLR的表達與快慢羽表型形成沒有直接關系，不是理想的雞快慢羽候選基因，融合基因dPRLR/dSPEF2和SPEF2基因是候選基因的有力競爭者。因此，融合基因dPRLR/dSPEF2可代替ev21基因作為慢羽型雞檢測的分子標記。

2 國內分子自別雌雄技術的應用

目前分子自別雌雄技術已廣泛應用于我國多個雞快慢羽品系選育。初芹等[29]研究建立了一種熒光定量 PCR方法對公雞慢羽基因型進行檢測和判定，快速實現(xiàn)了北京油雞慢羽純系的構建，應用2種四系雜交配套試驗，驗證羽速自別雌雄的準確性，結果發(fā)現(xiàn)北京油雞2種配套系自別雌雄鑒別率公母雛分別為 99%和97.98%以上，該方法在生產(chǎn)中具有較好的應用前景。陳忠等[30]利用找到的雞快羽和慢羽基因，采用雙重PCR方法建立了一種高效的雞快、慢羽分子鑒定方法，在快慢羽自別雌雄雞群體當中驗證表明準確率達100%。采用該方法和經(jīng)典表型鑒定方法對同一群雞進行快慢羽判定，結果發(fā)現(xiàn)，除表型鑒定為微長型的個體與分子鑒定結果符合率為94.1%外,其他羽型符合率均達100%。

李珊珊等[31]利用雞性連鎖羽速基因K/k中慢羽基因K與禽白血病內源性病毒基因ev21的緊密連鎖關系，PCR擴增241只140日齡麒麟公雞的URa、URb基因和ev21基因，限制性內切酶HaeⅢ篩選純合型慢羽公雞。結果慢羽公雞擴增出2條帶，快羽公雞只有1條帶。基因分型表示擴增處2條帶的為ev21缺失個體，擴增出3條帶的是雜合個體，只有1條帶的為純合個體，說明ev21插入位點可以作為鑒定麒麟雞基因型是否為純合的慢羽個體的標記。李培周等[32]利用ev21分子標記對清遠麻雞中個體進行檢測和分型，結果發(fā)現(xiàn)ev21基因插入位點的分子檢測與表型鑒定一致率達到98.8%，110日齡的體重和冠高呈高強度正相關。

珍珠雞與家雞的動物學分類地位相差甚遠，1日齡珍珠雞無法通過翻肛鑒別性別，直接影響其管理和生產(chǎn)流程。為解決珍珠雞早期性別鑒定的問題, 王章等[33]分析了珍珠雞快、慢羽遺傳特征以及利用快慢羽建立自別雌雄配套系的可能性，利用CHD-1基因對珍珠雞實施早期性別鑒定，性別鑒定結果與陽性對照家雞的條帶一致，公母間出現(xiàn)差異，且與180日齡珍珠雞性成熟時的翻肛鑒定結果一致。結果表明CHD-1基因在家雞與珍珠雞間遺傳特征相同，在珍珠雞快慢羽自別雌雄品系尚未建立前，可用于珍珠雞早期性別鑒定。

宋丹丹等[34]應用ev21基因和融合基因dPRLR/dSPEF2研究HW1系黑羽烏骨雞快慢羽，結果發(fā)現(xiàn)慢羽烏骨雞的K基因上同時含有上述2種基因，且PCR檢測的結果和出雛時的羽速觀察分型結果完全一致，說明ev21和dPRLR/dSPEF2可作為烏骨雞快慢羽分子標記的篩選區(qū)域，達到準確區(qū)分慢羽公雞純合(ZKZK)與雜合(ZKZk)、加快品系選育進程之目的。

3 分子鑒定自別雌雄技術展望

前人是通過建立快慢羽自雌雄系來進行雞雌雄自鑒別，但需要對慢羽公雞的純雜性進行鑒定。隨著分子技術的發(fā)展和對K基因結構的深入研究，學者們發(fā)現(xiàn)慢羽表型的K基因含有ev21基因，可以通過ev21基因對K基因進行檢測，進而減少工作量。但越來越多的研究表明,并不是所有種類的雞其慢羽表型的K基因都含有ev21基因，從而發(fā)現(xiàn)了更多的基因能夠對K基因進行分子標記和檢測。因此，不論未來用哪種基因對K基因進行標記，但通過對K基因進行分子標記和檢測這一方法，從而實現(xiàn)自別雌雄是可行的，而且此方法與其他方法相比更準確更簡捷且適用于推廣。