王碩玥，梁子敬，陳琳，吳宗福

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是革蘭陽性菌，豬的重要致病菌，可引發(fā)豬的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。該菌也是一種重要的人畜共患病原，世界各地都有人感染豬鏈球菌的報道；在我國出現(xiàn)的2次暴發(fā)，1998年的江蘇和2005年的四川，分別造成14人和39人死亡。該菌血清型眾多，迄今報道可感染人的血清型有9種，分別為2型、4型、5型、9型、14型、16型、21型、24型和31型，其中血清2型對豬和人致病性最強[2-4]。

細菌的有氧新陳代謝和宿主的免疫活性細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，可產(chǎn)生活性氧，如超氧化物、過氧化氫(H2O2)、羥自由基等[5]。產(chǎn)生的活性氧可對細菌的蛋白質(zhì)、脂類和DNA等大分子造成損傷[6]；另外，產(chǎn)生的H2O2還可與Fe2+通過芬頓反應，產(chǎn)生強氧化能力的羥基自由基，對細菌具有殺傷作用[7]。為避免受活性氧的損傷，不同的細菌具有不同的抗氧化應激策略：有些可分泌毒素，損傷巨噬細胞，或者抑制巨噬細胞產(chǎn)生活性氧；有些能表達超氧化物歧化酶(SOD)可將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2，進而被過氧化氫酶轉(zhuǎn)化為水和氧；有些則利用谷胱甘肽過氧化物酶，將谷胱甘肽(GSH)和H2O2氧化為G-S-S-G和水，進而G-S-S-G被谷胱甘肽還原酶還原為GSH；有些可產(chǎn)生特殊的抗氧化劑直接結(jié)合活性氧，起到抗氧化作用，如銅綠假單胞菌產(chǎn)生的藻朊酸鹽；另外，有些還可過表達熱休克蛋白起到抗氧化應激的作用[5,8]。目前對豬鏈球菌抗氧化應激機制的了解還很有限。

本研究通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的比較蛋白組學方法，尋找H2O2應激條件下的差異表達蛋白，并從中選擇2個新發(fā)現(xiàn)的抗氧化應激蛋白通過基因敲除、H2O2應激及小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬和存活等試驗，驗證其生物學功能，研究結(jié)果為進一步揭示豬鏈球菌的抗氧化應激機制和致病機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

THB(Todd-Hewitt Broth)培養(yǎng)基購自美國BD公司；綿羊血購自北京鼎國生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；2×Rapid Taq Master Mix、DNA片段回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 菌株、細胞和培養(yǎng)條件

豬鏈球菌2型毒力株P1/7 由本實驗室保存；細菌菌株在THB液體或THA平板(5%瓊脂粉)中于37 ℃培養(yǎng)箱或搖床(180 r/min)下培養(yǎng)。小鼠巨噬細胞 RAW 264.7(ATCC TIB-71)購自美國ATCC公司；在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)。

1.3 全菌蛋白提取及LC-MS/MS分析

將P1/7凍存菌劃于血平板復蘇，挑取單菌落，在5 mL THB培養(yǎng)液于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)8 h，按1∶100轉(zhuǎn)接至20 mL THB(1∶50加血清)培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入H2O2(終濃度20 mmol/L)作用20 min后，于4 ℃，8 000 r/min下離心10 min，去上清液，10 mL PBS洗滌3次，液氮速凍后于-80 ℃保存。對照組不經(jīng)H2O2處理。取菌體沉淀加入適量SDT裂解液(4% SDS、100 mmol/L Tris-HCl pH 7.6、100 mmol/L 二硫蘇糖醇)，轉(zhuǎn)移至預先裝有適量石英砂的2 mL離心管中，應用MP勻漿儀進行勻漿破碎(6.0 m/s，60 s，2次)。然后超聲(80 W，運行10 s，間歇15 s，循環(huán)10次)，沸水浴15 min。14 000g離心40 min，取上清采用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液。采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量，分裝樣品，-80 ℃保存。每個菌株3個生物學重復。

樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司，進行FASP酶解及LC-MS/MS分析。差異蛋白的篩選標準為與對照組相比，差異表達倍數(shù)超過2倍且P<0.05。

1.4 YED、AHH缺失株的構(gòu)建

缺失株的構(gòu)建參照文獻[9]，引物見表1，由南京擎科生物有限公司合成。采用兩步篩選法，第一步通過Spc耐受為正向篩選，第二步以蔗糖敏感(sacB)作為反向篩選，經(jīng)染色體基因組自身同源重組完成無痕替換。

1.4.1 Spc耐受正向篩選

以P1/7基因組為模板，以ΔYED-A、ΔYED-B(ΔAHH-A、ΔAHH-B)為引物擴增上游臂ΔYED-AB(ΔAHH-AB)；以SacB-F、Spc-R為引物擴增sacB-spc片段；以ΔYED-C、ΔYED-D(ΔAHH-C、ΔAHH-D)為引物擴增下游臂ΔYED-CD(ΔAHH-CD)；以ΔYED-AB、sacB-spc、ΔYED-CD(ΔAHH-AB、sacB-spc、ΔAHH-CD)為模板，以ΔYED-A、ΔYED-D(ΔAHH-A、ΔAHH-D)為引物進行融合PCR，反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 22 s(30個循環(huán))；72 ℃ 10 min。將PCR融合產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA片段回收試劑盒切膠回收。挑取P1/7單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期，按1∶40轉(zhuǎn)接至20 mL THB培養(yǎng)至OD600=0.04 ～ 0.05(約20 ～ 60 min)；取100 μL菌液，添加5 μL信號肽(GNWGTWVEE)，10 μL上述 PCR三段融合產(chǎn)物；于37 ℃下靜置培養(yǎng)2 h，涂布于TS平板(含100 μg/mL spc的THA)；次日挑取單菌落進行PCR鑒定[10]。

1.4.2 sacB反向篩選

以P1/7基因組為模板，用ΔYED-A、ΔYED-B1(ΔAHH-A、ΔAHH-B1)為引物擴增上游臂ΔYED-AB1(ΔAHH-AB1)；以ΔYED-C1、ΔYED-D(ΔAHH-C1、ΔAHH-D)為引物擴增下游臂ΔYED-C1D(ΔAHH-C1D)；以ΔYED-AB1、ΔYED-C1D(ΔAHH-AB1、ΔAHH-C1D)為模板，以ΔYED-A、ΔYED-D(ΔAHH-A、ΔAHH-D)為引物進行融合PCR，反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(30個循環(huán))；72 ℃ 10 min。將PCR融合產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA片段回收試劑盒切膠回收。挑取P1/7有痕缺失株ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期，按1∶40轉(zhuǎn)接至20 mL THB培養(yǎng)至OD600=0.04～0.05(約20～60 min)；取100 μL菌液，添加5 μL信號肽，10 μL上述PCR兩段融合產(chǎn)物；于37 ℃下靜置培養(yǎng)2 h，涂布于THA平板(含10%蔗糖)；次日挑取單菌落進行PCR鑒定，且擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序[10]。

表1 引物

引物名稱引物序列(5′-3′)擴增產(chǎn)物ΔYED-ACTTGGGAGAAGACCAGAGGCAGAAAΔYED-BCTTCAAGGAGTTTTCAGCATTATCCGACAGAAAAGACGCGATTGGGCCAG第一步:YED上游同源臂ΔYED-CATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTAAGATTTTTAAGATTCCTTTCGTAΔYED-DCCACATCATACTGACGAGTGTAG第一步:YED下游同源臂ΔYED-B1AATCTTAAAAATCTTGACAGAAAAGACGCGATTGGGCCAG第二步:YED上游同源臂ΔYED-C1AAGATTTTTAAGATTCCTTTCGTA第二步:YED下游同源臂ΔYED(inter)-XTTTCTGAGTTGCCTCGTCΔYED(inter)-YTGCAAAACATGATGCGCCAA鑒定ΔYED無痕缺失株ΔYED-FACAGGAAAACAACTACCAΔYED-RAGTCTTCACGGTCCAAAAΔYED無痕缺失株測序ΔAHH-ACTTGAAGCAATACCTATCGCΔAHH-BCTTCAAGGAGTTTTCAGCATTATCCTTGCCTCTGATACTAGGTTT第一步:AHH上游同源臂ΔAHH-CATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTGGCTAGATGCTTCATGGTΔAHH-DCGCCAGATTCATTTTCAG第一步:AHH下游同源臂ΔAHH-B1ATGAAGCATCTAGCCTTGCCTCTGATACTAGGTTT第二步:AHH上游同源臂ΔAHH-C1GGCTAGATGCTTCATGGT第二步:AHH下游同源臂ΔAHH(inter)-XCAAGCAAGTCCGATACCACΔAHH(inter)-YCCCTAGACAAATTAGCCAGT鑒定ΔAHH無痕缺失株ΔAHH-FTTAACACAGTCCCAAAGGCTAΔAHH-RGTGCAACATTTGTGTCTGAΔAHH無痕缺失株測序SacB-FGGATAATGCTGAAAACTCCTTSpc-RAATCTGATTACCAATTAGAATGAATATsacB-spc片段

1.5 P1/7、ΔYED和ΔAHH菌株生長曲線的測定

挑取P1/7、ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期，按1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL THB培養(yǎng)，每隔1 h測量OD600，分別繪制各菌株的生長曲線。每個菌株3個生物學重復。

1.6 抗氧化應激試驗

挑取P1/7、ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期，按1∶100轉(zhuǎn)接至5 mL THB(1∶50加血清)培養(yǎng)至OD600≈0.6；各取500 μL菌液，THB稀釋10倍，即 5 mL，加入20 μL 30% H2O2(終濃度40 mM)分別作用0 min、20 min，各取100 μL經(jīng)PBS作10倍比稀釋，選擇3個合適濃度，涂布于THA平板進行計數(shù)。相對存活率%=CFU20 min/CFU0 min。每個菌株3個生物學重復。

1.7 RAW264.7吞噬與存活試驗

挑取P1/7、ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期，按1∶100轉(zhuǎn)接至5 mL THB培養(yǎng)至OD600≈0.6。各取5 mL菌液，于4 ℃，8 000 r/min離心5 min，用PBS洗2次，DMEM重懸至OD600≈0.6。取5×105～7×105/mL RAW264.7細胞鋪入24孔板(每孔中有500 μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)液)，生長12 ～18 h(約80%)。吸凈液體，DMEM洗3遍，并用臺盼藍法計算出每孔所含的細胞數(shù)。然后以感染比(細菌∶細胞)≈100∶1的比例將菌液分別添加到24孔板中。室溫下800g離心10 min，于37 ℃，5% CO2下孵育1 h。用不含血清的DMEM洗RAW267.4細胞3遍，在含100 μg/mL慶大霉素和5 μg/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1 h、3 h后，洗滌3次，1 mL ddH2O裂解細胞，對每孔進行細菌計數(shù)。吞噬率為抗生素處理1 h后巨噬細胞內(nèi)的細菌數(shù)占原始接菌數(shù)的比值。將抗生素處理1 h后的巨噬細胞內(nèi)細菌數(shù)作為100%，計算3 h細菌在巨噬細胞內(nèi)的存活率。胞內(nèi)存活率%=CFU3 h/CFU1 h。每個試驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，均采用t檢驗分析，*表示差異性顯著(P<0.05)，**表示差異性極顯著(P<0.01)；***表示差異性極顯著(P<0.001)。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS比較蛋白組學分析

提取豬鏈球菌全菌蛋白，以THB培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌作為對照，經(jīng)H2O2處理后，LC-MS/MS共鑒定出54個差異表達蛋白，其中28個蛋白在H2O2處理組中上調(diào)表達，26個蛋白下調(diào)表達。這些差異表達的蛋白主要參與代謝、生物合成、抗應激等過程。將全部的差異表達蛋白逐一經(jīng)NCBI BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)有10種蛋白可能與豬鏈球菌抗氧化應激有關(見表2)。其中黃素蛋白、精氨酸脫亞胺酶和氨基甲酸激酶已有文獻報道與該菌抗氧化應激有關；另外7個蛋白是可能的抗氧化應激相關蛋白：YbaB/EbfC家族核苷相關蛋白(YED)、2-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶二磷酸激酶(AHH)、硫氧還蛋白(SSU0223)、UvrC蛋白(SSU0702)、核苷DNA結(jié)合蛋白(SSU1458)、3-氧代?；?[?；d體蛋白]合酶3(SSU1607)、碳酸酐酶(SSU1820)。本研究選擇YED和AHH進行深入研究，并驗證其是否具有抗氧化應激特性。

2.2 YED、AHH對豬鏈球菌生長特性的影響

成功構(gòu)建YED與AHH的基因缺失株ΔYED和ΔAHH。將野生株P1/7、ΔYED和ΔAHH在100 mL THB 培養(yǎng)液中于37℃，180 r/min下培養(yǎng)，每隔1 h檢測OD600吸光值。如圖1所示，生長曲線結(jié)果表明各菌株在THB中無顯著差異。

表2 差異表達蛋白

基因名蛋白名稱表達倍數(shù)(H2O2/對照)P值SSU0175黃素蛋白3.41950.0120SSU0223硫氧還蛋白4.84480.0010SSU1458類核DNA結(jié)合蛋白21.74320.0000SSU0580精氨酸脫亞胺酶0.45000.0226SSU16073-氧代酰基-[?；d體蛋白]合酶30.45780.0254SSU0184YbaB/EbfC家族核苷相關蛋白(YED)+SSU0702UvrC蛋白+SSU09862-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶二磷酸激酶(AHH)+SSU1820碳酸酐酶+SSU0583氨基甲酸激酶-

注：+表示該蛋白在H2O2處理組特有；-表示該蛋白在對照組特有

圖1 P1/7、ΔYED和ΔAHH的生長曲線

2.3 YED、AHH對豬鏈球菌抗氧化應激能力的影響

為驗證YED、AHH對豬鏈球菌抗氧化應激能力的影響，將P1/7、ΔYED和ΔAHH在含有H2O2(終濃度為40 mmol/L)的THB培養(yǎng)基中，于37℃下作用20 min。如圖2所示，與野生株P1/7相比，ΔYED和ΔAHH對抗H2O2應激能力極顯著降低。

注：**P<0.01

2.4 RAW264.7吞噬與存活試驗

采用小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞，探究YED、AHH對豬鏈球菌抗巨噬細胞吞噬和在巨噬細胞內(nèi)存活的影響。如圖3A所示，RAW264.7細胞對野生株和2個缺失株ΔYED與ΔAHH的吞噬率無顯著差異(P>0.05)；存活試驗(圖3B)顯示，經(jīng)抗生素處理3 h后，與P1/7相比，缺失株ΔYED和ΔAHH在巨噬細胞內(nèi)存活率極顯著下降(P<0.001)。

注：與P1/7組相比，***P<0.001

圖3 P1/7、ΔYED和ΔAHH的吞噬率(A)及其在小鼠巨噬細胞RAW264.7內(nèi)存活率(B)

3 討論

本研究采用蛋白質(zhì)組方法，鑒定豬鏈球菌抗氧化應激蛋白。發(fā)現(xiàn)的54個差異表達蛋白中，有3個報道與豬鏈球菌抗氧化應激有關。由基因SSU0175編碼的黃素蛋白，在H2O2應激條件下顯著上調(diào)表達，該蛋白又稱為NADH 氧化酶(Nox)[11]；該基因缺失后豬鏈球菌對抗H2O2應激能力、在血液中存活能力、對豬和小鼠的致病力均顯著降低[12]。經(jīng)H2O2處理，顯著下調(diào)的蛋白中有2個蛋白(精氨酸脫亞胺酶和氨基甲酸激酶)報道與豬鏈球菌的氧應激有關，這兩個蛋白分別由SSU0580和SSU0583基因編碼，屬于精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)(ADS)[13]；豬鏈球菌在低氧條件下ADS上調(diào)表達，而在高氧條件下ADS下調(diào)表達[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)7個新蛋白可能與豬鏈球菌新的抗氧化應激相關。YED蛋白為YbaB/EbfC家族核苷相關蛋白，屬于DNA結(jié)合蛋白，在原核生物中廣泛分布[15]；流感嗜血桿菌、大腸桿菌和伯氏疏螺旋體中的該蛋白參與修復受損的DNA構(gòu)象[16]；伯氏疏螺旋體該蛋白過表達后顯著影響該菌4.5%基因的表達，包括與DNA重組、復制及修復相關的基因，感染相關基因和細菌適應性相關基因[17]，后者以較高的突變率幫助細菌迅速適應外界環(huán)境[18]；變鉛青鏈霉菌缺失含該基因的操縱子后，對于DNA損傷劑的敏感性增強。本試驗發(fā)現(xiàn)，YED基因缺失后，豬鏈球菌在H2O2應激下的存活率降低，說明YED與該菌抗氧化應激有關。推測H2O2造成DNA損傷后，豬鏈球菌通過上調(diào)表達YED蛋白，參與修復受損傷的DNA，抵御氧化應激。AHH蛋白是2-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶二磷酸激酶，參與四氫葉酸的合成；四氫葉酸作為一碳單位(C1)的供體，參與蛋氨酸、嘌呤及胸腺嘧啶的生成[19]；酵母菌lba57蛋白以葉酸為輔因子，參與鐵硫簇蛋白的合成和修復；大腸桿菌Iba57同源基因ygfZ的缺失，對氧化應激高度敏感，且降低鐵硫簇蛋白的活性[20-21]，而后者在細菌中參與多種重要生物學過程，如DNA修復、基因調(diào)控、代謝等[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，AHH基因缺失可導致豬鏈球菌在H2O2應激下存活能力下降，說明AHH參與該菌抗氧化應激。推測H2O2應激條件下，豬鏈球菌通過上調(diào)表達AHH蛋白，參與鐵硫簇蛋白的合成和修復，從而有利于抗氧化應激。另外5種蛋白本研究未做功能分析。SU0223基因表達的蛋白是一種硫氧還蛋白，通過其活性中心二硫鍵參與氧化還原反應；SSU0702編碼的UvrC蛋白和SSU1458編碼的DNA結(jié)合蛋白參與受損傷DNA的修復[23-24]；SSU1820基因編碼的是碳酸酐酶，能清除氧化應激損傷的細胞[25]；SSU1607所編碼的3-氧代?；?[酰基載體蛋白]合酶3，在H2O2應激條件下顯著下調(diào)表達，該酶的功能是催化生成酰基載體蛋白，銅綠假單胞菌的酰基載體蛋白通過抑制過氧化氫酶的活性，參與氧化應激反應[26]。這5個蛋白是否參與H2O2應激及在豬鏈球菌致病中的作用值得后續(xù)深入研究。

巨噬細胞將致病菌吞入后形成吞噬體，經(jīng)一系列成熟過程，最終形成吞噬溶酶體，清除致病菌[27]。其中產(chǎn)生活性氧是巨噬細胞清楚病原菌的主要方式之一：巨噬細胞中的NADPH氧化酶可催化產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，對細菌的蛋白質(zhì)、脂類和DNA造成損傷[6]；在酸性的吞噬溶酶體內(nèi)，O2-可迅速轉(zhuǎn)化為H2O2或與一氧化氮反應生成過氧亞硝酸鹽，從而對細菌發(fā)揮殺傷作用[6]；另外，產(chǎn)生的H2O2還可與Fe2+通過芬頓反應，產(chǎn)生強氧化能力的羥基自由基，發(fā)揮殺菌功能[7]。本研究發(fā)現(xiàn)YED和AHH參與豬鏈球菌抗氧化應激，因此這2個蛋白促進豬鏈球菌在巨噬細胞內(nèi)存活可能主要通過抗氧化應激方式發(fā)揮作用。

綜上，本研究通過鑒定在H2O2應激條件下的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)7個新的蛋白可能參與豬鏈球菌抗氧化應激，為揭示豬鏈球菌的抗氧化應激機制提供參考；其中YED和AHH與豬鏈球菌在吞噬細胞內(nèi)存活相關，提示它們在豬鏈球菌致病過程中發(fā)揮作用。