衣雪潔，孫玉霞，姚婷婷，李 晶，高 暢，劉 璐，曹師承，常 波，張翠萍

(1.沈陽體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院, 遼寧 沈陽 110102；2.中國醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)教研室, 遼寧 沈陽 110001)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種發(fā)病原因尚不明確的慢性疾病。2015年糖尿病地圖數(shù)據(jù)顯示[1]世界成年糖尿病患者高達(dá)4.15億人，預(yù)測到2040 年糖尿病成年患者將高達(dá)6.42億。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)作為糖尿病的重要組成部分，其發(fā)病率約占整個(gè)DM人群的90%以上。T2DM患者為自身胰島素敏感性低，出現(xiàn)胰島素抵抗。胰島素抵抗的機(jī)制較為復(fù)雜，年齡的增長和長期的高脂飲食會(huì)引起骨骼肌、脂肪、肝臟等組織胰島素抵抗，出現(xiàn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、氧化異常，脂肪和骨骼肌是糖、脂代謝的重要器官，在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展以及防治中發(fā)揮重要的作用。有研究表明磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路是調(diào)節(jié)糖代謝的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]，其表達(dá)異?？捎绊懲庵芷咸烟沁\(yùn)載體4(glucose transporter，GLUT4)的合成、分泌、轉(zhuǎn)位，引起外周組織糖代謝異常，進(jìn)而引起血糖升高。有研究表明：T2DM患者骨骼肌PI3K/AKT/GLUT4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同程度損害，導(dǎo)致骨骼肌糖轉(zhuǎn)運(yùn)異常，糖的氧化利用下降，引發(fā)骨骼肌胰島素抵抗。脂肪細(xì)胞是能量的儲(chǔ)存器官，其在糖代謝中的作用往往不被重視，Abale等的研究顯示[1]，選擇性降低小鼠脂肪組織GLUT4的表達(dá)，即使肌肉中的GLUT4表達(dá)正常，胰島素刺激的骨骼肌對(duì)葡萄糖攝取能力也會(huì)下降40%，提示脂肪細(xì)胞GLUT4表達(dá)的下降可能誘導(dǎo)其它組織發(fā)生胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。運(yùn)動(dòng)是防治T2DM的重要手段。關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路的影響存在爭議，且研究多集中在骨骼肌。多數(shù)研究表明，長期有氧運(yùn)動(dòng)可增加骨骼肌PI3K和AKT的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及活性。但對(duì)T2DM大鼠脂肪組織PI3K/AKT/GLUT4的研究還未見報(bào)道。本研究通過高脂膳食結(jié)合小劑量STZ建立T2DM大鼠模型，探討長期有氧運(yùn)動(dòng)和一次性運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠血糖、血脂及脂肪組織中PI3K、AKT和GLUT4的蛋白表達(dá)的影響，為揭示運(yùn)動(dòng)干預(yù)改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制及探尋2型糖尿病的干預(yù)方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

15月齡雄性SD大鼠52只(由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取13只作為正常對(duì)照組(NC組)，給以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其余39只為高脂組(HF組)，以高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料的成份[3]見表1，(飼料由沈陽前民飼料廠生產(chǎn))。組間體重?zé)o顯著差異。10周后高脂組體重超過NC組的20%以上。給高脂組大鼠一次性腹腔注射STZ，25 mg/kg。注射STZ后的第 2、4 周時(shí)，采血測定血糖，血糖≥ 16.7 mmo l/L 為達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn)[4]，剔除血糖小于16.7 mmol/L大鼠5只。將其余34只造模成功大鼠隨機(jī)分成糖尿病對(duì)照組(Diabetes control group，DC組，10只)，糖尿病慢性運(yùn)動(dòng)組(Diabetes Chronic Exercise Group，DCE組，12只)，糖尿病急性運(yùn)動(dòng)組(Diabetes Acute Exercise Group，DAE組12只)。分組后體重血糖見表2。分組后各組小鼠的飲食方案不變，DCE和DAE進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，NC和DC組不施加任何干預(yù)，8周后統(tǒng)一時(shí)間取材。

Tab. 1 Nutritional formula of feed during mouse feeding(g/100 g)

Tab. 2 Body weight and blood glucose after grouping in rats

NC: Normal control group; DC: Diabetic control group; DCE: Diabetic chronic exercise group; DAE: Diabetic acute exercise group

1.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

在750 cm×115 cm，水溫為30℃的泳池中，對(duì)DCE組進(jìn)行8周的游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，每周運(yùn)動(dòng)6 d，游泳時(shí)間見表3。DAE組在取材前12 h進(jìn)行2次45 min的游泳，間隔45 min，與DCE組末次的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷相同。

Tab. 3 DCE group exercise scheme(min)

W：Week

1.3 取材

游泳干預(yù)8周后對(duì)所有大鼠進(jìn)行取材，所有組在取材前禁食12 h，DCE組觀察長期運(yùn)動(dòng)引起的適應(yīng)性反應(yīng)，為排除末次運(yùn)動(dòng)的應(yīng)激反應(yīng)影響，取材時(shí)間定在末次運(yùn)動(dòng)后36～48 h；DAE組觀察一次性運(yùn)動(dòng)的應(yīng)激反應(yīng)，由于一次性運(yùn)動(dòng)的應(yīng)激反應(yīng)一般在運(yùn)動(dòng)后24 h減弱或消失，因此取材的時(shí)間定在一次性運(yùn)動(dòng)后12～16 h。稱重后腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(80 mg/kg)進(jìn)行麻醉，主動(dòng)脈取血，制備血清。迅速分離腎周、腸系膜周圍脂肪，稱重后液氮冷凍保存。由于在運(yùn)動(dòng)過程中出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象，取材后，將各組標(biāo)本均隨機(jī)取8只測量所需指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)的測定

體重：電子秤稱量大鼠體重；血糖：用血糖儀測定血糖；血脂四項(xiàng)：利用半自動(dòng)生化分析儀(中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒)；血清胰島素：放免法(北京中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所125I-胰島素放射免疫分析藥盒)；PI3K、AKT1、AKT2、GLUT4蛋白表達(dá)含量測定：Western blot印跡分析方法。取 100 mg 樣品加入 400 μl蛋白裂解液，1 μl蛋白酶抑制劑，勻漿、離心、取上清；BCA 法測定蛋白含量；每泳道上樣量為 30 μg。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，封閉后一抗孵育過夜。洗去多余一抗，于脫色搖床上避光孵育二抗1 h。掃描條帶，測量灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重，空腹血清胰島素、血糖濃度

如表4所示，與NC組比，DC組體重，血清胰島素，血糖水平顯著升高(P<0.01)。與DC組比，DCE組血清胰島素，血糖水平顯著降低(P<0.01)，體重下降但無顯著性差異(P>0.05);DAE組血清胰島素，血糖水平降低(P<0.05)，體重基本無變化。

Tab. 4 Comparison of body weight, serum insulin, blood glucose

**P<0.01vsNC group；#P<0.05，##P<0.01vsDC group

2.2 各組大鼠血脂濃度(TG、TC、HDL-C、LDL-C)

如表5所示，與NC組相比，DC組的TG、TC、LDL-C含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量顯著降低(P<0.01)；與DC組相比，DCE組和DAE組的TG、TC、LDL-C均顯著降低(P<0.05)，HDL-C含量均顯著升高(P<0.05)

Tab. 5 comparison of TG, TC, HDL-C and LDL-C

TG：Triglyceride；TC：Total cholesterol；HDL-C：High density liptein cholesterol；LDL-C：Low density liptein cholesterol

**P<0.01vsNC group；#P<0.05vsDC group

2.3 大鼠脂肪PI3K，AKT1，AKT2，GLUT4表達(dá)水平

如圖1所示，與NC組相比，DC組PI3K、AKT1、AKT2和GLUT4含量顯著降低(P均<0.01，表6)。與DC組相比，DCE，DAE組PI3K、AKT1、AKT2和GLUT4含量顯著升高(P<0.01，P<0.05；P<0.01，P<0.01；P<0.01，P<0.01；P<0.01，P<0.05)

Tab. 6 Comparison of PI3K，AKT1，AKT2，GLUT4 relative protein levels

PI3K：Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase; AKT: Protein kinase B; GLUT4: Glucose transporter 4

**P<0.01vsNC;#P<0.05,##P<0.01vsDC

Fig. 1 PI3K，AKT1，AKT2，GLUT4 protein expression

**P<0.01vsNC group；#P<0.05，##P<0.01vsDC group

3 討論

大量研究表明，年齡老化和肥胖與胰島素抵抗關(guān)系密切，肥胖中老年人群IR和T2DM發(fā)病率明顯高于同年齡正常人群。T2DM患者常表現(xiàn)為肥胖和糖、脂代謝紊亂，并以血糖和TG、TC、LDL升高，HDL-C下降為特點(diǎn)[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，長期的高脂飲食引發(fā)肥胖和脂代謝紊亂，并發(fā)高血脂和高游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)，F(xiàn)FA的升高會(huì)誘發(fā)骨骼肌、肝臟等器官胰島素抵抗，糖的氧化利用和糖原的合成減少，使血糖升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：糖尿病對(duì)照組大鼠血糖、血清胰島素、血脂均顯著升高,相反HDL-C則顯著下降。進(jìn)一步證明：長期的高脂飲食結(jié)合小劑量的STZ可有效的誘導(dǎo)大鼠糖脂代謝紊亂，誘發(fā)大鼠產(chǎn)生T2DM。一些研究表明，外周胰島素抵抗是引發(fā)2型糖尿病的主要原因，脂肪和骨骼肌作為外周器官分別發(fā)揮著能源物質(zhì)的儲(chǔ)存和利用作用，在2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，也是運(yùn)動(dòng)改善胰島素抵抗的重要作用靶器官。

GLUT4穿梭于細(xì)胞的內(nèi)外膜，能在胰島素的作用下刺激骨骼肌攝取葡萄糖[6]。在這個(gè)過程中 PI3K /AKT信號(hào)通路發(fā)揮重要作用，胰島素激活PI3K /AKT信號(hào)通路后可引起GLUT4的構(gòu)象發(fā)生改變，由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到骨骼肌中，從起到降低血糖的作用[7]。長期高脂飲食引發(fā)的肥胖下調(diào)骨骼肌GLUT4總量，抑制細(xì)胞內(nèi)膜GLUT4向細(xì)胞外膜的轉(zhuǎn)位[8]。但2型糖尿病和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)脂肪細(xì)胞PI3K /AKT信號(hào)通路影響的報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：糖尿病大鼠脂肪組織中PI3K、AKT1、AKT2和GLUT4的蛋白表達(dá)均顯著下降。提示T2DM脂肪細(xì)胞PI3K/AKT/GLUT4通路受損，可能是脂肪組織產(chǎn)生胰島素抵抗原因之一。另外T2DM引起的糖脂代謝紊亂，會(huì)引起脂肪組織中FFA 濃度超過正常水平時(shí)，過量的FFA會(huì)對(duì)細(xì)胞以及細(xì)胞器產(chǎn)生“脂毒性”作用，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[9]、氧化應(yīng)激[10]、凋亡及炎癥等。有研究發(fā)現(xiàn)，這種脂毒性作用可下調(diào)胰島素介導(dǎo)的PI3K/AKT/GLUT4通路，抑制外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和氧化利用。Abale等[1]選擇性降低小鼠脂肪組織GLUT4的表達(dá)，肌肉中的GLUT4表達(dá)正常，但胰島素刺激的骨骼肌對(duì)葡萄糖攝取能力下降40%，提示脂肪細(xì)胞GLUT4表達(dá)的下降可能誘導(dǎo)其它組織發(fā)生IR。TaKahash[11]的研究同樣證實(shí)脂肪細(xì)胞中GLUT4含量的減少可能由GLUT4轉(zhuǎn)錄障礙引起。

有氧運(yùn)動(dòng)是降低體重和減脂的有效方法手段，并在臨床T2DM的防、治中發(fā)揮作用。人體[12]和動(dòng)物[13]實(shí)驗(yàn)表明，長期運(yùn)動(dòng)能有效降低體重、血糖，改善血脂紊亂。本實(shí)驗(yàn)顯示：一次性運(yùn)動(dòng)可在12～16 h以內(nèi)引起體內(nèi)產(chǎn)生糖、脂代謝的應(yīng)激反應(yīng)，但并不能有效的降低體重；8周的游泳運(yùn)動(dòng)可有效的降低體重、血糖和胰島素水平，改善血脂紊亂，并將這一結(jié)果保持在末次運(yùn)動(dòng)后36～48 h，但其作用的機(jī)制還不太清楚。

運(yùn)動(dòng)是防治T2DM的重要手段[14-16]。但對(duì)PI3K/AKT/GLUT4的影響結(jié)果不盡一致，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)：運(yùn)動(dòng)可有效提升2型糖尿病大鼠骨骼肌PI3K/AKT/GLUT4的蛋白表達(dá)，改善胰島素抵抗[17]。但HOLTEN[18]在對(duì)健康成年人和糖尿病患者進(jìn)行遞增負(fù)荷力量訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)每次運(yùn)動(dòng)不少于30 min，6次/周，6周后，運(yùn)動(dòng)并不增加PI3K p85亞基的蛋白含量。本研究結(jié)果顯示：急性運(yùn)動(dòng)12～16 h和長期有氧運(yùn)動(dòng)36～48 h后均可以上調(diào)脂肪組織PI3K/AKT/GLUT4蛋白的表達(dá)，增加組織對(duì)葡萄糖的利用，緩解T2DM引起的糖、脂代謝異常，且長期運(yùn)動(dòng)的效果優(yōu)于一次性運(yùn)動(dòng)。有研究顯示[19]，運(yùn)動(dòng)可以增加脂肪細(xì)胞和骨骼肌GLUT4的表達(dá)，提高IR狀態(tài)下，脂肪和肌肉組織對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，從而改善胰島素抵抗Hussey[20]的研究也證實(shí)，急性運(yùn)動(dòng)能夠增加2型糖尿病患者骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)。

綜上所述，T2DM使脂肪PI3K/AKT/GLUT4通路受損，可能是引發(fā)機(jī)體糖、脂代謝異常的原因之一。一次性運(yùn)動(dòng)引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)上調(diào)了該通路的蛋白表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)血糖的攝?。婚L期運(yùn)動(dòng)則通過適應(yīng)性反應(yīng)緩解脂肪組織PI3K/AKT/GLUT4通路受損，改善糖脂代謝紊亂，緩解胰島素抵抗。